作者简介:李启彭(1987—),男,云南会泽人,讲师,博士,研究方向为无机及分析化学,E-mail:83064313@qq.com。
分别设计单因素实验和正交实验,优化昭通葡萄中黄酮的提取工艺,并采用紫外分光光度法测定其含量。研究结果表明,最佳提取工艺为乙醇体积分数为60%,料液比为1:10,提取90 min,提取温度80 ℃。以芦丁为标准溶液,在510 nm处测定昭通葡萄的黄酮含量,该方法的回收率为98.6%~110.4%,相对标准偏差小于1%,可作为葡萄中黄酮的提取工艺及含量测定的新方法。
葡萄(Vitis vinifera L)又称提子, 是落叶木质藤本植物, 果实不仅美味可口, 而且富含维生素、黄酮和各种氨基酸等营养成分, 具有很高的营养价值[1, 2]。其中, 黄酮类化合物对“ 三高” 有一定疗效, 也具有扩张冠状动脉和脑血管等功效[3, 4, 5, 6]。黄酮的提取方法主要有回流法, 超声波提取法和超临界萃取法, 测定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法和比色法等[7, 8, 9, 10]。目前, 关于葡萄中黄酮的提取工艺及测定方法的报道还比较少, 需要建立简单、易重复和精度高的提取新工艺和测试方法[11, 12, 13]。
云南省昭通的地理和气候等因素, 有利于葡萄的生长, 果实品质优越, 深受人们喜爱。由于黄酮具有良好的药用价值, 探索昭通葡萄中黄酮的高效提取工艺和快速准确的测定方法, 为昭通葡萄的开发利用提供理论依据。
供试葡萄有红玫瑰葡萄和巨峰葡萄, 均为昭通特产, 购买自昭通市农贸市场。新鲜葡萄用清水洗净, 然后剥皮, 将果皮和果肉分别烘干, 粉碎, 过40目筛(孔径0.42 mm)备用。
称取芦丁标准品25 mg置于烧杯中, 用70%的乙醇溶解, 然后转移到100 mL容量瓶中, 定容到刻度, 即得到0.25 mg· mL-1标准液[14]。量取0.25 mg· mL-1标准溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和10.0 mL分别置于25 mL容量瓶中, 分别加入5% NaNO2溶液1 mL摇匀, 静置5 min, 加入1% Al(NO3)3溶液1 mL摇匀, 静置5 min, 加入4% NaOH溶液10 mL, 用70%乙醇定容, 放置10 min [14]。用紫外分光光度计在460~550 nm间测定溶液的吸光度, 得到芦丁的最大吸收波长曲线和标准溶液的工作曲线。
1.3.1 提取溶剂
分别称取1 g红玫瑰葡萄皮在3个圆底烧瓶中, 分别加入10 mL甲醇、乙醇和水, 80 ℃回流提取2 h, 冷却后过滤, 滤液转移到50 mL容量瓶中, 定容到刻度。分别量取2.0 mL提取液于25 mL容量瓶中, 然后加入5% NaNO2溶液1 mL, 1% Al(NO3)3溶液1 mL, 4% NaOH溶液10 mL, 定容到刻度, 摇匀, 然后在510 nm波长测定其吸光度[14]。
1.3.2 脱脂
分别称取1 g红玫瑰葡萄皮置于2个圆底烧瓶中, 一个瓶内加入5 mL石油醚, 另外一个为空白对照, 进行脱脂处理, 研究脱脂和不脱脂对黄酮提取效果的影响[14]。
设计乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、提取温度(C)和料液比(D)为4个主要考察因素, 每个因素设计3个水平, 选用L9(34)表设计实验[15], 以葡萄中黄酮的得率为考察指标, 获得最佳的提取工艺(表1)。3个水平1、2、3, 分别对应A乙醇体积分数50%、60%、70%, B提取时间60、90、120 min, C提取温度60、70、80 ℃, D料液比1:10、1:20、1:30 g· mL-1。
在最佳提取工艺条件下, 分别称取1 g(红玫瑰和巨峰)的果皮和果肉进行提取实验, 在波长为510 nm下测定其吸光度。按照上述方法重复3次, 并计算相对标准偏差[15]。此外, 分别在果皮样品中加入20 mg, 葡萄果肉样品中加入5 mg的芦丁标准样品, 在相同条件下进行回收率实验。
随着扫描波长增加, 吸光度逐渐增加, 在510 nm波长处出现最大吸收峰; 再增加扫描波长, 吸光度开始下降, 故确定510 nm为芦丁的最大吸收波长[15]。此外, 取510 nm处的吸光度, 根据浓度和吸光度可得回归方程为:A=10.113 3 C+0.033 13, R2=0.999 84, 表明浓度为0.017~0.103 mg· mL-1时, 芦丁浓度和吸光度之间呈线性关系。
2.2.1 提取溶剂
采用乙醇、甲醇、水做提取溶剂, 样品在510 nm处的吸光度分别为0.425、0.208、0.367, 故采用乙醇提取效果最好, 水次之, 甲醇效果最差。可能因为乙醇沸点较低且容易挥发, 因此最佳提取溶剂是乙醇[14]。
2.2.2 样品脱脂
用石油醚进行脱脂后, 样品的吸光度为0.481, 比不脱脂处理的吸光度(0.243)大, 可能因为提取溶剂能溶解脂类物质, 降低对黄酮类物质的溶解。若对样品进行脱脂处理, 可以提高黄酮的得率[14]。
4个因素对黄酮提取率的影响为D> B> C> A。以得率作为昭通葡萄中黄酮提取的考察指标, 可以得最优提取工艺组合为A2B2C3D1, 即乙醇体积分数为60%, 提取时间为90 min, 提取温度为80 ℃和料液比为1:10, 此时得率为3.55%(表1)。
采用上述最佳提取工艺, 提取昭通特色葡萄中的黄酮, 并在最佳吸收波长510 nm处, 测定提取样品溶液的吸光度, 由回归方程求出2种葡萄中黄酮的含量。红玫瑰果皮含量最高为3.52%, 巨峰果皮为3.49%, 红玫瑰果肉为0.59%, 巨峰果肉为0.49%(表2), 表明2种葡萄中果皮黄酮含量比果肉的高, 本研究所得数值比文献[11-13]稍微偏低。
设计单因素实验和正交实验优化提取昭通葡萄中的黄酮, 并用紫外分光光度法测定其含量。该方法操作简便, 结果准确, 易重复且适用于基层实验室, 可作为昭通葡萄中黄酮的提取工艺及含量测定的新方法, 为昭通葡萄的开发利用提供理论依据。
The authors have declared that no competing interests exist.
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