引用本文
刘灿, 王婵, 左之才, 王正中, 李学伟, 马继登. 黄芪多糖对腹腔注射大肠杆菌小鼠TLR信号通路MyD88、ERK及细胞因子的影响[J]. 浙江农业科学, 2017,(1):143-146  
Permissions
Copyright©2017, 《浙江农业科学》编辑部
© 2014 《浙江农业科学》编辑部
黄芪多糖对腹腔注射大肠杆菌小鼠TLR信号通路MyD88、ERK及细胞因子的影响
刘灿1, 王婵1, 左之才1,*, 王正中1, 李学伟2, 马继登2
1.四川农业大学动物医学院 环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室,四川 雅安 625014
2.四川农业大学动物科技学院 动物遗传育种研究所,四川 成都 611130
通讯作者:左之才,E-mail:zzcjl@126.com。

作者简介:刘 灿(1993—),女,四川郫县人,本科,从事中西兽医与临床工作,E-mail:1107486614@qq.com。

基金项目: 四川省科技支撑计划项目(2013NZ0032)
摘要

研究黄芪多糖调节动物机体的基本免疫应答的机理。试验选取了132只健康小鼠饲养并采样,其中6只为初始对照记为感染前72 h(-72 h),其余小鼠分为3组。Ⅰ组为黄芪多糖组(66 mg·kg-1灌胃黄芪多糖),Ⅱ组为模型组(66 mg·kg-1蒸馏水灌胃),Ⅲ组为健康对照组(66 mg·kg-1蒸馏水灌胃),每日1次,连用3 d;试验第4天,Ⅰ、Ⅱ组小鼠腹腔注射大肠杆菌液(0.1 mL·只-1),Ⅲ组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。在注射后0、3、6、12、24、48、168 h,每组随机选取6只小鼠眼球采血分离血清,采用ELISA试剂盒检测MyD88、ERK、TNF-α、IL-6指标。与Ⅲ组比较,Ⅱ组小鼠在0~48 h的MyD88、ERK、TNF-α、IL-6均升高。与Ⅱ组比较,Ⅰ组小鼠在0 h的MyD88、ERK、TNF-α均升高,在3~24 h 的MyD88、ERK,在3~12 h的IL-6均显著下降( P<0.05),TNF-α在168 h显著升高( P<0.05)。感染大肠杆菌会明显激活小鼠MyD88-ERK通路,但当预防用黄芪多糖激活小鼠MyD88-ERK通路后,再感染大肠杆菌时则并不能引起MyD88-ERK通路的进一步激活。预防用黄芪多糖可减轻大肠杆菌感染引起的应激反应,缓解其引起的MyD88-ERK通路激活,进而达到调节机体免疫平衡的作用。

关键词: 黄芪多糖; 大肠杆菌; ERK通路; 炎症
中图分类号:S856.3 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2017)01-0143-04 doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20170146

Toll受体(Toll-ike receptor, TLR)信号通路在自身免疫中有着非常重要的作用[1], 内毒素(lipopolysaccharide, LPS)为大肠杆菌的致病因子之一, 主要激活机体TLR信号通路, 引起机体炎症反应。LPS与LBP(脂多糖结合蛋白)结合后, 通过CD14传递给TLR4/MD2复合体, 形成异源二聚体, 通过两种不同的接头蛋白启动两条信号通路:TIRAP-MyD88[髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88)]通路(MyD88依赖性途径)及TRIF-TRAM通路(非MyD88依赖性途径)。在MyD88依赖性途径中, 通过一系列胞内信号转导因子的信息传递可激活IKK/NF-κ B及丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)途径, MAPKs包括ERK(细胞外信号调节激酶)、P38、JNK, 当他们被激活后可诱导核转录因子AP-1进入胞核, 启动一系列与应激相关的炎性介质如TNF-α (肿瘤坏死因子-α )、IL-1(白细胞介素-1)、IL-6(白细胞介素-6)等合成[2]。ERK, 称为细胞外信号调节激酶。当其被激活时可进入核内, 磷酸化AP-1, 调控基因的表达[3, 4, 5]。TNF-α 是由巨噬细胞和单核细胞产生的炎性细胞因子, 有免疫调节、参与发热和炎症发生的功能[6]。IL-6主要由T细胞、B细胞等细胞产生, 是参与免疫调节和炎性反应的重要细胞因子之一[7]。另一方面, 非MyD88依赖性途径主要通过TRIF/IRF3诱导IFN-β (干扰素-β )的产生[8, 9, 10]。

黄芪多糖作为一种具有多重功效的天然提取物质, 对机体免疫系统具有非常广泛的调节作用, 能全面提高机体的免疫监视和免疫防御功能, 增强免疫力, 抵抗外界不良因素的侵害[11]。为进一步探讨黄芪多糖作为感染性疾病预防用药的科学性与合理性, 试验研究预防用黄芪多糖对腹腔注射大肠杆菌小鼠MyD88依赖性途径ERK以及下游细胞因子的影响。

1 材料与方法
1.1 试验动物

清洁级昆明小鼠132只, 6~8周龄, 体重18~22 g, 雌雄各半, 购自四川大学华西医学中心实验动物中心。

1.2 试验药物

黄芪多糖注射液(质量体积比10 mg· mL-1), 成都乾坤动物药业有限公司, 批号:20150601。

1.3 试验菌株及菌液配制

大肠杆菌(E.coli)从患水肿病竹鼠腹腔积液中分离, 由四川农业大学兽医内科实验室保存。对该菌的前期研究表明, 该大肠杆菌对昆明小鼠的LD0为1.7× 107, LD50为9.9× 107, LD100为4.3× 108。本试验参照此菌对昆明小鼠的最大耐受量作为注射浓度。

将E.coli复苏并接种于5 mL MH肉汤培养基37 ℃培养16~18 h, 用平板菌落计数法, 估算其菌液浓度, 再将菌液浓度稀释至约为1.7× 108 mL-1, 备用。

1.4 主要试剂及仪器

全自动荧光酶标分析仪(PR-521)。小鼠MyD88、ERK、TNF-α 和IL-6的ELISA检测试剂盒, 均购自武汉基因美生物科技有限公司(Lot. 201601)。

1.5 试验动物分组及处理

待小鼠适应饲养后, 按照性别、体重选取6只未作任何处理的健康小鼠直接采样, 作为各组小鼠的初始对照, 记为-72 h; 另将精神、体况接近的126只小鼠按照性别、体重分为3组。其中Ⅰ 组为黄芪多糖组; Ⅱ 组为模型组; Ⅲ 组为健康对照组。Ⅰ 组于每日8:00, 将制备的黄芪多糖按66 mg· kg-1灌胃, 每日1次, 连用3 d, Ⅱ 、Ⅲ 组灌胃同体积蒸馏水。在试验第4天上午8:00, Ⅰ 、Ⅱ 组小鼠腹腔注射大肠杆菌液(0.1 mL· 只-1), Ⅲ 组小鼠腹腔注射0.1 mL生理盐水。在注射后0、3、6、12、24、48、168 h, 每组随机处死6只小鼠, 通过眼球采血法获取血液分离血清, 进行试验。各组按常规饲养管理。

1.6 样本采集与检测指标

1.6.1 临床观察

观察小鼠自主活动、体重变化、皮毛、呼吸、摄食、饮水、排泄、死亡等情况。

1.6.2 检测指标及方法

于试验各个时间点, 每组随机选取6只小鼠, 摘除眼球采血0.7 mL, 4 ℃ 3 000 r· min-1离心20 min, 分离血清, -20 ℃保存备用。按照试剂盒说明书测定血清中MyD88、ERK、TNF-α 、IL-6的含量。

1.7 数据处理

用SPSS 11.0软件进行方差分析和多重比较, 数据用平均值± 标准差表示。P< 0.05表示差异显著, P< 0.01表示差异极显著, P> 0.05表示差异不显著。

2 结果和分析
2.1 各组小鼠腹腔注射大肠杆菌前后的临床表现

腹腔注射大肠杆菌前各组小鼠精神状况良好, 饮、食欲正常。腹腔注射大肠杆菌后, 小鼠相继出现患病症状, 其中Ⅰ 组仅有部分小鼠在注射后3~12 h有精神稍差、活动减少的表现; 24 h后小鼠的行为表现及精神状态基本恢复正常。Ⅱ 组在注射后3 h, 多数小鼠的饮、食欲显著下降, 并出现蜷缩现象; 6 h左右, 部分小鼠精神高度沉郁、呼吸急促, 部分小鼠眼周出现分泌物等症状; 12 h左右, 小鼠病情基本稳定, 与6 h时观察到的症状相似, 且可见被毛无光泽; 24 h左右, 小鼠逐渐恢复正常, 较上次观察时活泼, 饮、食欲有所增加; 注射48 h及1周(168 h)后, 小鼠精神状况良好, 饮、食欲正常。Ⅲ 组小鼠精神状况良好, 饮、食欲正常。各组小鼠均无死亡。

2.2 小鼠血清中MyD88的变化

与Ⅲ 组相比, Ⅱ 组小鼠血清MyD88含量在6~24 h均极显著或显著升高(表1)。组内相比, Ⅱ 组小鼠在6 和12 h的MyD88含量极显著高于-72、0、48和168 h, 呈先升高后下降的变化趋势, 在12 h达到峰值; Ⅲ 组小鼠各时间点的指标间变化不显著。

表1 小鼠血清中MyD88含量的变化ng· mL-1

Ⅰ 组小鼠在0 h血清中的MyD88含量极显著高于Ⅱ 组, 与Ⅲ 组差异不显著。Ⅱ 组在3 h的MyD88含量极显著高于Ⅰ 组; Ⅱ 组在6、12、24 h的MyD88含量均显著或极显著高于Ⅰ 组。从总体上看, Ⅰ 组小鼠在感染后的MyD88含量呈下降、升高、下降、升高的变化趋势, 但整体幅度变化较小, 差异不显著。

上述结果表明, 单独腹腔注射大肠杆菌可使小鼠血清中的MyD88含量显著升高; 但当用黄芪多糖预防3 d, 小鼠血清中的MyD88升高后, 再腹腔注射大肠杆菌并不引起血清中MyD88的进一步增高。

2.3 小鼠血清中ERK的变化

由表2可见, Ⅱ 组小鼠在3~12 h血清ERK含量均极显著高于Ⅲ 组, 其余时间点差异不显著。Ⅱ 组小鼠的ERK含量, 在3 h达到峰值并极显著高于其他各时间点; 在6 h、12 h极显著高于-72、0、24、48、168 h。Ⅲ 组小鼠在各时间点的ERK含量差异不显著。

表2 小鼠血清中ERK含量的变化ng· mL-1

Ⅱ 组小鼠在3、6、12、24 h的ERK含量极显著高于Ⅰ 组。Ⅰ 组小鼠各时间点的ERK含量差异不显著。

结果显示, 使用3 d黄芪多糖后, 可有效减缓感染大肠杆菌引起的小鼠ERK的升高。

2.4 小鼠血清中TNF-α 的变化

与Ⅲ 组相比, Ⅱ 组小鼠血清中TNF-α 含量在3~24 h均极显著升高(表3)。组内相比, Ⅱ 组在3 h的TNF-α 含量极显著高于-72、0、48、168 h, 呈先升高后下降的变化趋势, 在3 h达到峰值; Ⅲ 组小鼠各时间点的指标间变化不显著。

表3 小鼠血清中TNF-α 含量的变化 ng· L-1

Ⅰ 组小鼠在0 h的TNF-α 含量均极显著高于Ⅱ 、Ⅲ 组。Ⅰ 组在感染3、6、12、24、48 h的TNF-α 含量与Ⅱ 组无明显差异, 而在感染168 h的TNF-α 含量极显著高于Ⅱ 组。Ⅰ 组小鼠在感染后TNF-α 含量呈先下降、后升高的变化趋势, 但整体幅度变化较小, 差异不显著。

结果显示, 使用3 d预防用黄芪多糖后, 可升高TNF-α 水平, 而感染大肠杆菌后并不进一步升高TNF-α 水平。单独感染大肠杆菌可明显升高TNF-α 水平。

2.5 小鼠血清中IL-6的变化

与Ⅲ 组相比, Ⅱ 组小鼠血清中IL-6含量在各时间点均无显著差异(表4)。组内相比, Ⅱ 组在3 h的IL-6含量极显著高于-72、0、12、24、48、168 h, 呈升高、下降、升高的趋势变化, IL-6在3 h达到峰值。Ⅲ 组小鼠各时间点的指标间变化不显著。

表4 小鼠血清中IL-6的变化ng· L-1

在使用黄芪多糖3 d(0 h)后, 各组小鼠的IL-6含量均无显著差异。Ⅰ 组小鼠在感染3、6、12 h的IL-6含量极显著低于Ⅱ 组; 感染24、48、168 h, 各组无显著差异。总的来看, Ⅰ 组小鼠在感染后IL-6含量呈下降、升高的变化趋势。

结果显示, 使用3 d预防用黄芪多糖后, 可轻度抑制小鼠IL-6水平, 而感染大肠杆菌后继续抑制IL-6。单独感染大肠杆菌可升高IL-6水平。

3 讨论
3.1 腹腔注射大肠杆菌对小鼠MyD88依赖途径ERK及下游细胞因子IL-6、TNF-α 的影响

革兰氏阴性菌侵入机体后释放出LPS, 引起机体炎症应答。小鼠腹腔内注射大肠杆菌会诱发急性腹膜炎, 引起严重的内毒素血症, 致使小鼠出现感染性休克症状, 最终死亡。而内毒素血症可激活各类免疫细胞释放多种炎性介质和细胞因子, 如 TNF-α 、lL-6等[12]。

本试验中, 当小鼠腹腔注射大肠杆菌后, Ⅱ 组小鼠血清中MyD88含量在12 h达到峰值, ERK含量在3 h达到峰值, 而细胞因子 IL-6、TNF-α 含量也在3 h 达到高峰, 随后呈下降趋势。表明细菌侵入机体后, 激活MyD88依赖途径, 在0~3 h激活ERK 通路, 持续至12 h。ERK通路在0~3 h的强力激活使得细胞因子 IL-6、TNF-α 大量释放, 引起强烈炎症反应。

3.2 黄芪多糖对腹腔注射大肠杆菌小鼠MyD88依赖途径ERK及下游细胞因子IL-6、TNF-α 的影响

从各组小鼠MyD88的变化可以看出, 黄芪多糖组小鼠MyD88在6 h显著降低后又逐渐升高, 且整体表现为MyD88水平低于模型组。由此推测黄芪多糖可能通过抑制感染大肠杆菌小鼠的TLR4通路中MyD88接头蛋白的水平, 从而减轻机体受到的炎症损害。有研究指出, 单味中药其有效成分或中药复方可通过阻断或抑制TLR4信号通路中MyD88的表达, 从而减轻炎症损害[8]。

邵晓轶等[13]指出在LPS诱导大鼠雪旺氏细胞TNF-α 表达中, ERK信号通路的激活可能是LPS诱导TNF-α 表达的前提, 从而诱导TNF-α 、IL-6等细胞因子的释放, 诱导炎症损伤。试验中, 黄芪多糖组小鼠ERK在3 h急剧下降, 极显著低于模型组和对照组, TNF-α 、IL-6也出现显著下降, 整体均表现为黄芪多糖组显著低于模型组。张蕴颖[14]、李冬方[15]在研究黄芪多糖对炎症模型细胞所释放的炎症因子中发现, 黄芪多糖能够显著下调IL-6、TNF-α 表达。小鼠灌胃黄芪多糖3 d, MyD88、ERK、TNF-α 均升高, 而对IL-6轻度抑制, 表明预防用黄芪多糖可激活MyD88-ERK通路。当腹腔注射大肠杆菌后, 黄芪多糖组在0~48 h MyD88、ERK、TNF-α 、IL-6水平较感染组低, 表明感染会激活MyD88-ERK通路, 而预防用黄芪多糖可减轻或适度抑制感染引起的MyD88-ERK通路的进一步激活。可见, 预防用黄芪多糖可减轻感染所致的应激反应, 调节机体免疫平衡, 进而达到增强机体免疫功能的目的。

综上所述, 感染大肠杆菌会明显激活小鼠MyD88-ERK通路, 但当预防用黄芪多糖激活小鼠MyD88-ERK通路后, 再感染大肠杆菌时则并不引起MyD88-ERK通路的进一步激活。预防用黄芪多糖可减轻大肠杆菌感染引起的应激反应, 缓解其引起的MyD88-ERK通路激活, 进而达到调节机体免疫平衡的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献:
[1] 方居正. 活血化瘀法对急性心肌梗死病人血清前胶原蛋白Ⅲ的影响[J]. 中国中医药现代远程教育, 2009, 7(7): 9-10. [本文引用:1]
[2] AKIRA S. Mammalian Toll-like receptors[J]. Current Opinion in Immunology, 2003, 15(1): 5-11. [本文引用:1]
[3] 刘启, 赵志英. ERK和JNK信号转导通路与疾病关系的研究进展[J]. 医学综述, 2011, 17(11): 1637-1639. [本文引用:1]
[4] EBLEN S T, SLACK J K, WEBER M J, et al. Rac-PAK signaling stimulates extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation by regulating formation of MEK1-ERK complexes[J]. Molecular and cellular biology, 2002, 22(17): 6023-6033. [本文引用:1]
[5] CHEN J W, CHEN Y H, LIN S J. Long-term exposure to oxidized low density lipoprotein enhances tumor necrosis fctor-alphm stimulated endothelial adhesiveness of monocytes by activating superoxide generation and redox-senative pathways[J]. Free Radic Biology and Medicine, 2006, 40(5): 817-826. [本文引用:1]
[6] 郑铭, 张幼怡, 韩启德. 肾上腺素受体的丝裂原活化蛋白激酶信号途径[J]. 生理科学进展, 2002, 33(2): l11-1l4. [本文引用:1]
[7] LUPPI P, LICATA A, HALUSZCZAK C, et al. Analysis of TCR Vbeta repertoire and cytokine gene expression in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy[J]. Journal of Autoimmunity, 2001, 16(1): 3-13. [本文引用:1]
[8] 王海坤, 韩代书. Toll样受体(TLRs)的信号转导与免疫调节[J]. 生物化学与生物物理进展, 2006, 33(9): 820-827. [本文引用:2]
[9] JIANG Z, MAK T W, SEN G, et al. Toll-like receptor 3-mediated activation of NF-κB and IRF3 diverges at Toll-IL-1 receptor domain-containing adapter inducing IFN-β[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(10): 3533-3538. [本文引用:1]
[10] HäCKER H, REDECKE V, BLAGOEV B, et al. Specificity in Toll-like receptor signalling through distinct effector functions of TRAF3 and TRAF6[J]. Nature, 2005, 439(7073): 204-207. [本文引用:1]
[11] 扬金明. 黄芪对S180荷瘤小鼠的免疫增强及抑瘤作用[J]. 中国临床免疫学杂志, 1995, 7(1): 41-44. [本文引用:1]
[12] 公衍玲, 王宏波, 孟林, 等. 胆必清颗粒治疗大鼠急性细菌性腹膜炎的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志, 2003, 23(S1): 203-205. [本文引用:1]
[13] 邵晓轶, 秦永伟, 王海波, 等. ERK在LPS诱导大鼠雪旺氏细胞TNF-α表达中的作用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2007, 27(6): 485-489. [本文引用:1]
[14] 张蕴颖, 鲍黎明. 黄芪多糖对冠心病患者血清TNF-α、IL-6、P-选择素、VCAM-1以及VEGF水平的影响[J]. 中国生化药物杂志, 2016(2): 142-144. [本文引用:1]
[15] 李冬方, 顾宁, 黄伟. 黄芪多糖对THP-1巨噬细胞HSP60诱导下IL-6、TNF-α表达的影响[J]. 时珍国医国药, 2015(12): 2830-2832. [本文引用:1]