9~10日龄SPF鸡胚, 来自山东省家禽研究所SPF鸡场。新城疫病毒GM0 811株为本科室自行分离, 经HA及HI实验鉴定为新城疫病毒。一次性6孔细胞培养板来自美国康宁公司; 0.22 μ m针孔滤器来自Millipore公司。DMEM高糖培养液、0.25%胰酶及小牛血清均为Hyclone产品; 琼脂糖为Oxoid 100 g原装产品; 0.1%中性红溶液、2× MEM溶液液等其他所需溶液均为自行配制。

1.2.1 鸡胚成纤维细胞制备

根据相关参考文献^{[2, 3]}, 取发育良好的9~10日龄SPF鸡胚, 无菌去壳取胚体, 并依此剪掉头、四肢及内脏, 用无菌PBS溶液漂洗3次, 去除红细胞。用无菌眼科剪将洗净的胚体剪碎, 倒入适量的0.25%胰酶37 ℃水浴消化约30 min, 期间摇晃震荡数次, 观察消化液呈白色粘稠状有拉丝现象时, 可置入含5%血清的DMEM培养液中终止消化, 充分吹打分散细胞团块, 用200目细胞筛过滤, 可得到鸡胚成纤维细胞悬液。计数后稀释成5× 10⁵个· mL^-1后, 接种于6孔细胞培养板内, 每孔接种5 mL混匀的细胞悬液。置5% CO₂培养箱37 ℃培养。

1.2.2 接毒浓度摸索

将鉴定合格的新城疫尿囊液冻融3次, 用一次性0.22 μ m针孔滤器过滤, 用DMEM高糖培养液将病毒液10倍倍比稀释成10^-1~10^-10静置待用^{[4, 5]}。将长成良好细胞单层的鸡胚成纤维细胞弃去原培养液, 用无菌PBS洗涤2次以去除残留的血清, 将稀释好的病毒液10^-1~10^-10分别加入2个6孔培养板, 每个稀释度1孔, 每孔0.9 mL, 最后一孔加等量的无血清DMEM培养液做对照。置入37 ℃ CO₂培养箱吸附1 h, 期间每隔15 min摇晃1次, 使之均匀接触细胞。1 h后, 吸弃病毒液, PBS洗去未吸附的病毒粒子。

1.2.3 琼脂糖覆盖液的准备

预先准备好A液和B液。配方如下。A液(100 mL):pH值7.2的2× MEM溶液95 mL, 小牛血清 5.0 mL, 混匀过滤, 置37 ℃预热。B液(100 mL):根据参考文献共准备4个浓度, 1.6 g、1.8 g、2.0 g、2.2 g琼脂糖, 分别溶于100 mL的PBS液中, 121.3 ℃高压灭菌15 min后, 在液体状态下置56 ℃水浴待用。将预热的A液分别与B液分别取等量混合, 制成4种不同浓度的琼脂糖最终覆盖液, 每种浓度加入一块上述处理好的6孔培养板中, 2 mL每孔, 操作过程中尽量避免气泡产生。待覆盖液冷却凝固后置37 ℃的CO₂培养箱, 并逐日观察细胞病变(cytopathic effect, CPE)。

1.2.4 蚀斑染色

待出现CPE时, 向各培养板中加第2层含0.01%中性红的琼脂糖, 每孔1 mL, 操作同上。凝固后, 将培养板倒置, 放入37 ℃ CO₂培养箱继续培养, 4 h或过夜后观察细胞蚀斑情况。

1.2.5 细胞培养特性观察并挑斑

待培养板中出现清晰的蚀斑时, 将200 μ L枪头剪去头部高压灭菌, 选择蚀斑数较少, 斑与斑间距较大的平板进行底部标记, 连同琼脂糖一起吸取并置入1 mL PBS溶液中, 摇晃分散, 冻融3次, 3 000 r· min^-1离心10 min, 取上清, 记为Clone1, 于-20 ℃保存备用。将Clone1毒株稀释后再次按上述方法接种鸡胚成纤维细胞, 蚀斑纯化3次。并分别将纯化后的病毒接种SPF鸡胚, 对其收获的尿囊液进行常规HA效价检测。

鸡胚成纤维细胞生长速度较快, 以长成密度稍高的单层为佳, 太空了在洗涤时细胞层容易从培养板上脱落, 或者因无细胞形成的空洞与病毒形成的蚀斑较易混淆。密度太高了则容易多层细胞积聚在一起, 导致有蚀斑形成的地方可能会因底层细胞没有感染而无法形成可见蚀斑。

最佳稀释倍数需要根据病毒毒力进行摸索调整, 一般蚀斑形成能力与毒力成正相关, 毒力越强的病毒蚀斑形成能力越强, 如果接种稀释倍数过低, 则蚀斑形成太大, 容易连成片, 不好进行挑斑, 如果毒力较弱, 而接种稀释倍数过高, 则不宜形成蚀斑, 无法进行病毒纯化。先摸索感染稀释度, 毒价较低的时候, 适当降低稀释倍数, 这与文献报道^{[6, 7]}相一致。低毒力的新城疫毒株在复制时, 前体糖蛋白F0敏感性较低, 裂解为F1和F2的能力较弱, 加入适量的胰酶可增强病毒粒子的感染性, 因此, 可以在覆盖琼脂中加入适量的胰酶或镁离子增强细胞的蚀斑形成能力。

琼脂糖是从琼脂中去除了对细胞有害的物质后提炼而来, 能将病毒粒子固定于某个位置形成局限性病灶。琼脂糖的浓度配比对蚀斑纯化实验操作较大影响, 浓度过高则在操作过程中凝固过快, 过低则凝固过慢, 均影响实验操作。不同厂家生产的琼脂糖硬度也不同, 本实验所用以1.8%最佳。

蚀斑技术主要用于病毒的纯化, 其原理是由于病毒的遗传变异, 一般的病毒株都是由许多特性不一的病毒粒子组成的混杂群体, 通过蚀斑技术, 选育出性状相同、产斑条件和产斑时间相同的克隆株, 来保证所需毒株的免疫原性及毒力特性稳定。该技术适用于多种病毒的纯化。在具体的毒株纯化操作中, 要根据毒株毒力不同, 混合情况不同, 所用试剂供应厂家不同等对实验条件逐步进行优化摸索。