用于ELISA测试, 标记物一般是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、丙酮酸脱氢酶以及重组的β -半乳糖苷酶^{[5, 6]}。这些酶促反应往往会导致基质降解, 形成有色的生成物, 然后借助分光光度计, 检测这些有色生成物。

Liu等^[7]采用阳离子牛血清白蛋白(BSA)的免疫原与氯丙嗪缀合, 制备了一种针对氯丙嗪的单克隆抗体, 并且开发出一种间接式对抗型的ELISA分析方法, 用于检测鸡肝与猪肝中的氯丙嗪。这种抗体对氯丙嗪的灵敏度高, 其IC₅₀平均值为0.73 μ g· L^-1, 且检测数据稳定。Liu等^[8]制备了针对达氟沙星的抗体, 并且创建了一种对抗型的ELISA分析法, 用于监测鸡肝中的达氟沙星; 其IC₅₀为2.0 μ g· L^-1, 检测下限为0.8 μ g· L^-1, 该检测结果与LC/MS分析法的检测结果一致。与此类似, 科学家们也制成了针对加替沙星与培氟沙星的抗体^[9], 分别用于检测鸡肝与牛奶中的加替沙星与培氟沙星。近些年, ELISA分析法已被广泛用于检测不同基质中的兽药, 包括四环素^[10]、羟氨苄青霉素^[11]、呋喃唑酮^{[12, 13, 14]}、呋喃妥因^[15]、磺胺^{[16, 17]}以及己烷雌酚^[18]。

另外, 通过与生物素-链霉亲和素体系结合, 经典的ELISA分析法的灵敏度得到明显改善。这种体系是以生物素与链酶亲和素的高特异性和强亲和力为基础的, 它可以使更多的酶催化基质。Wang等^[19]通过生物素-链霉亲和素ELISA分析法, 测定牛奶中的氯霉素残留物, 其检测下限是0.042 ng· g^-1, 其灵敏度是传统对抗型ELISA的8倍。

ELISA也可以对在各种基质中的多种兽药残留物进行多重分析。Zhang等^[17]开发了一种直接式对抗型的ELISA分析法, 用来检测猪肉、鸡肉、鱼以及蛋提取物中的7种磺胺残留物。Chá fer-Pericá s等^[16]开发了一种间接式对抗型的ELISA分析法, 用来检测鱼样品中的3种磺胺残留物— — 磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嗪、磺胺嘧啶。这些抗菌药的检测极限(LOD)低于100 ng· g^-1。

对蛋白质生物标记物的灵敏定量检测是免疫分析法设计的关键。目前已开发出信号放大的各种方法, 诸如以量子点(QDs)为基础的分析方法。量子点属于一种新的发光荧光团, 优于多种传统的荧光染料。与有机荧光团相比, 量子点表现出更为显著的亮度与光稳定性以及超强的生物兼容性^[20]。Chen等^[21]开发了一种间接式以量子点为基础的荧光免疫分析法, 用于检测鸡肉中的恩诺沙星, 以量子点为基础的QIA的IC₅₀值可以达到8.3 ng· g^-1。

量子点具有窄的发射与宽的激励光谱, 这意味着它有可能用一种单一的激励激光波长来激励不同的量子点。此外, 通过改变纳米晶体的尺寸与材料类型, 量子点的发光颜色可以不同。因此, 对抗生素分析而言, 可以实现多重分析物检测。Peng等^[22]已开发出一种多重荧光免疫分析法, 通过制备生物素变性的牛血清白蛋白(Bt-dBSA)涂覆的碲化镉(CdTe)量子点缀合物, 同时对3种兽药进行检测。3种抗体分别与3种不同的量子点缀合, 在1块微孔板的1个孔井内对2种化合物进行检测。这种方法的LOD值分别为0.16、0.06与0.14 ng· g^-1。另外, 也有学者使用量子点作为荧光标记对磺胺二甲嘧啶残留物进行检测, 把量子点纳米晶体与对磺胺二甲嘧啶的单克隆抗体(MAb)耦合^[23], 或者把量子点纳米晶体与二级抗体耦合^[24], 测定鸡肉或牛奶中的磺胺二甲嘧啶残留物, 其IC₅₀平均值分别为7.7与4.3 ng· g^-1。

大多数免疫分析通常都是在实验室进行的, 因此, 在产品被商业化之前需要很长的时间; 然而, 人们对食品链始端进行现场监控的要求日益迫切。使用检测试纸可对兽药进行快速检测(图2)^[25]。在检测试纸条中, 目前发展最成熟和最常用的胶体金试纸条, 采用胶体金免疫层析技术研制而成, 以硝酸纤维素膜为载体, 利用了微孔膜的毛细管作用, 滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗透, 通过抗原抗体结合, 并利用胶体金呈现颜色反应, 检测抗原抗体。其基本原理参见图2。

图2

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	图2 胶体金试纸条的结构与原理

Zhu等^[26]利用快速而灵敏的胶体金免疫层析法检测试条, 检测鸡肉与肝脏中的12种喹诺酮类。被检测的氟喹诺酮与用于金标记抗体的膜片上结合的抗原对抗, 当在膜片上不再有游离的金标记抗体时, 试验线消失, 但控制线始终出现。对于被污染的鸡肉与肝脏中检测到的氟喹诺酮, LOD值低于50 ng· g^-1。从样品制备到检测, 整个过程可以在10 min内完成。

常见的免疫传感器有2种:一种是以酶为基础的生物传感器, 其检测信号是通过一种缀合酶(如酪氨酸酶和乙酰胆碱酯酶)的抑制所提供的; 另一种是光学表面等离子体共振(SPR)生物传感器^{[27, 28]}。SPR是一项流通型生物传感器技术, 当物质被结合到金属表面上时, SPR可以测量金属表面折射率产生的微小变化。

Crooks等^[29]开发了一种快速免疫分析法, 使用1种光学生物传感器检测猪胆汁中的磺胺二甲嘧啶。Samsonova等^[30]探讨了检测牛肝中抗寄生虫药伊维菌素的生物传感器免疫分析法, 采用的传感器是以SPR为基础的Biacore光学仪器, 检测下限达19.1 ng· g^-1; 肝脏样本水平增加到100(伊维菌素的最大残留量极限)与50 ng· g^-1时, IC₅₀平均值分别为93.7、43.2 ng· g^-1。Haughey等^[31]开发了一种用于检测克伦特罗的生物传感器分析法, 该方法以抑制原理为基础, 在分析物抗体结合到固定在传感器芯片表面的药物时, 对分析物抗体进行检测, 样品中克伦特罗的量越高, 抑制的水平将会越高。Thompson等^[32]开发了一种生物传感器分析法, 用于对猪、牛、绵羊的肾, 禽类的肝, 血清、鸡蛋和牛奶中的硝基咪唑化合物进行多重残留物的筛查; 来自于20个峰值样品的分析结果显示, 这种方法对所有样本中的二甲硝基咪唑的检测能力小于1 ng· g^-1。

微阵列芯片技术是以检测系统为基础的阵列, 以固定在不同表面的小分子或蛋白质作为试样, 可适于各种筛查。微阵列已经被广泛用于执行高通量药物残留物筛查^{[33, 34]}。Zhong等^[35]开发了一种蛋白质微阵列免疫分析法, 用于检测鸡肉中的克伦特罗与磺胺二甲嘧啶, 克伦特罗的IC₅₀为39.6 ng· g^-1, 磺胺二甲嘧啶的IC₅₀为48.8 ng· g^-1; 传统的ELISA分析, 相应的IC₅₀分别为190.7与156.7 ng· g^-1; Rebe等^[36]利用SPR系统生物传感器结合微阵列检测庆大霉素和新霉素, 相应的IC₅₀分别为8与21 ng· g^-1, 灵敏度较高。Peng等^[37]创建了一种小分子的微阵列检测方法, 可同时检测食品中的氯霉素、克伦特罗与泰乐菌素, 每种分析物的校正曲线均显示出较高的灵敏度, 氯霉素、克伦特罗、泰乐菌素的IC₅₀分别为0.14、0.53、10.53 ng· g^-1。