引用本文
徐丽华, 陈冬祥, 姚邦, 候贤宏, 游新根, 管妙东, 王一成. 台州地区规模猪场主要疫病的流行病学调查[J]. 浙江农业科学, 2017,(3):493-496  
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台州地区规模猪场主要疫病的流行病学调查
徐丽华1, 陈冬祥2, 姚邦2, 候贤宏3, 游新根4, 管妙东5, 王一成1,*
1.浙江省农业科学院,浙江 杭州 310021
2.台州市畜牧兽医局,浙江 台州 318000
3.椒江区畜牧兽医局,浙江 椒江 318000
4.路桥区畜牧兽医局,浙江 路桥 318000
5.温岭市畜牧兽医局,浙江 温岭 317500
通信作者:王一成,男,研究员,研究方向为畜禽传染病。

作者简介:徐丽华,女,助理研究员,E-mail:xulihua08@yeah.net。

基金项目: 院地合作农业科技项目(TYD-013)
摘要

选取浙江台州地区规模猪场为试验猪场,从2014年到2016年用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬野毒(PRV gE)抗体的阳性率,分析猪群免疫状况。同时采取临床可疑病料,用PCR及RT-PCR技术检测PRRSV、PCV2、SFV和PRV的感染率。结果显示:从2014年到2016年CSFV抗体阳性率从64.9%上升到80.4%;PRRSV和PCV2抗体阳性率变化不大,均处于高位;PRV gE抗体阳性率从52.5%下降到22.9%。在不同年龄段猪群中,母猪抗体水平最高,仔猪抗体水平逐渐下降,保育猪最低,抗体阳性率下降到50%以下,肥育猪阶段又有所回升。在病原检测中,2014年PRRSV、PCV2、SFV和PRV4种病原检出率均较高,其中PCV2检出率高达60%,到2016年4种病原检出率均下降到15%以下。本实验结果为控制猪场疫病和完善猪群免疫程序等防治措施提供了科学依据。

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV); 猪瘟病毒(CSFV); 猪圆环病毒2型(PCV2); 猪伪狂犬病毒(PRV); 酶联免疫吸附试验(ELISA); PCR; RT-PCR
中图分类号:S828.82 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2017)03-0493-04 doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20170341

浙江台州地区位于浙江省东南沿海, 山地资源丰富, 水路交通发达。近年来, 台州地区规模猪场增加, 生猪交易日益频繁, 远距离的运输和应激增加了猪群的疫病风险, 猪场猪群发病率明显提高, 损失惨重。目前猪群中流行的病原有猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪病毒性腹泻等10多种病毒性疫病, 混合感染和继发感染增多[1, 2, 3]。为了防控这些疫病, 规模猪场中往往进行高密度的疫苗免疫, 极易造成猪体免疫紊乱和免疫干扰现象。另一方面, 药物保健是目前规模猪场常规防疫技术之一, 但部分抗生素(如链霉素、氯霉素、四环素等)、糖皮质激素、性激素、环磷酰胺等药物即使在治疗量水平也会对生猪免疫器官和免疫细胞具有不同的抑制效应, 削弱生猪的免疫应答能力。所以, 规模猪场中免疫失败时有发生, 并且日趋严重, 给养殖户带来巨大经济损失[3, 4]。

为了较客观全面地了解台州地区规模猪场猪群主要疫病的免疫状况及流行情况, 为制订有效防治措施提供依据。在2014— 2016年本实验室采取台州地区规模猪场猪群的血清样本, 进行猪蓝耳病、猪瘟、猪圆环病毒病和猪伪狂犬病的血清学抗体检测, 同时对台州地区猪场的临床可疑组织病料进行病原检测, 分析当前规模猪场的疫病种类、流行状况、猪群免疫状况的变化动态, 为调整猪群免疫程序, 提高猪群存活率提供依据。

1 材料与方法
1.1 试剂和仪器

猪繁殖与呼吸道综合征病毒抗体检测试剂盒、猪瘟病毒抗体检测试剂盒和猪伪狂犬病毒gpI(gE)抗体检测试剂盒均为美国IDEXX公司生产, 购于杭州楚阳生物技术有限公司; 猪圆环病毒抗体检测试剂盒为韩国金诺公司生产, 购于杭州杰萌生物技术有限公司; 病毒RNA提取试剂盒为德国MN公司生产, 购于上海基因公司; 病毒RNA一步法试剂盒购于大连宝生生物科技有限公司; 病毒DNA提取试剂盒及1 000 bp DNA Marker均购自上海申能博彩生物科技有限公司(Lot: 0507); Taq DNA 聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、dNTPS等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司; 无水乙醇等化学试剂均为国产分析纯。

1.2 血样采集及病料来源

2014— 2016年上半年采取台州地区规模猪场各年龄段猪血液, 其中2014年采血815份, 2015年采血1 753份, 2016年采血469份。分离血清, -70 ℃保存备用。

2014— 2016年上半年对台州地区送检的临床疑似病料采样, 其中2014年采样31份, 2015年采样16份, 2016年上半年采样16份, 每份病料均无菌采取肺脏、脾脏、肾脏和淋巴结, -70 ℃保存备用。

1.3 血清抗体检测

按照酶联免疫吸附试验检测试剂盒中的说明书操作, 对猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒gE基因的抗体进行检测。

1.4 病料病原检测

1.4.1 引物设计

根据GenBank 中登录的PCV2 ORF2基因、PRV gE基因、PRRSV ORF1a基因的核苷酸序列, 应用DNAStar和Primer Premier软件分别设计了3对特异性引物, 委托上海生工生物工程有限公司合成。CSFV E2基因引物参考浙江大学动物科学院方维焕实验室。引物序列见表1。

表1 PRRSV、CSFV、PCV2和PRV用于 PCR反应的引物

1.4.2 病毒基因组DNA及RNA的提取

从-70 ℃取出临床病料0.1 g, 置于Eppendorf管中, 加入pH值7.4 PBS缓冲液0.5 mL, 用研磨棒研磨成匀浆, -70 ℃冻融3次, 离心取上清0.15 mL, 再用病毒DNA提取试剂盒及RNA提取试剂盒分别提取病毒DNA及RNA, 于-70 ℃保存。

1.4.3 RT-PCR扩增PRRSV及SFV

按照一步法RT-PCR检测试剂盒说明书操作。混匀分装后置PCR 扩增仪中, 扩增条件为:50 ℃ 30 min; 95 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。

因为SFV一步法扩增效率低, 容易造成漏检, 需进行第二套PCR反应。50 μ L 反应体系分别为:10× PCR Buffer 5.0 μ L, MgCl2(25 mmol· L-1)4.0 μ L, dNTPs(2.0 mmol· L-1)4.0 μ L, 引物F9/F10各4.0 μ L(浓度为5 μ mol· L-1), rTaq DNA ploymerase 0.5 μ L, SFV PCR产物为模板1.0 μ L, ddH2O 27.5 μ L。混匀后置PCR 扩增仪中, 扩增条件为:95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。

反应结束后, 取PCR产物5 μ L, 经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测, 用BIO-RAD成像系统观察拍照。

1.4.4 PCR扩增PCV2及PRV

按照常规PCR扩增方法, 扩增PCV2目的基因片段, 50 μ L 反应体系分别为:10× PCR Buffer 5.0 μ L, MgCl2(25 mmol· L-1)4.0 μ L, dNTPs (2.0 mmol· L-1) 4.0 μ L, 引物各4.0 μ L(浓度为5 μ mol· L-1), rTaq DNA ploymerase 0.5 μ L, 模板为4.0 μ L, ddH2O 24.5 μ L。混匀后置PCR 扩增仪中, 扩增条件为:95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 35个循环; 最后72 ℃延伸10 min。

PRV gE基因GC含量高, 用PrimeSTAR HS DNA扩增目的片段, 50 μ L反应体系分别为:2× PrimeSTAR GC Buffer 25.0 μ L, MgCl2(25 mmol· L-1)4.0 μ L, dNTPs(2.0 mmol· L-1)4.0 μ L, 引物(浓度为5 μ mol· L-1)各4.0 μ L, Prime STAR HS DNA 0.5 μ L, 模板为4.0 μ L, ddH2O 4.5 μ L。混匀后置PCR 扩增仪中, 扩增条件为:95 ℃ 5 min; 98 ℃ 15 s, 68 ℃ 45 s, 35个循环; 最后72 ℃延伸10 min。反应完成后, 取PCR产物5 μ L, 经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测, 用BIO-RAD成像系统观察拍照。

2 结果与分析
2.1 PRRSV、CSFV、PCV2、PRV病原检测

从2014年开始, 收集台州地区规模猪场中临床疑似病例, 其中2014年31份, 2015年16份, 2016年至今16份。分别检测PRRSV、CSFV、PCV2、PRV病原。结果(图1)显示, 在台州地区规模猪场中PRRSV、CSFV、PCV2和PRV均存在不同程度的感染; 在2014年, PRRSV、CSFV、PCV2和PRV4种病原的检出率均较高, 其中PCV2的检出率达到60%; 2015年和2016年4种病原的检出率持续下降, 到2016年上半年, 4种病原的检出率均下降到15%以下, 其中猪瘟检出率为0; 从2014年到2016年猪伪狂犬病毒检出率下降不大, 说明猪伪狂犬野毒在台州地区猪场中持续流行存在。

图1 2014— 2016年临床疑似病料中PRRSV、CSFV、PCV2、PRV检出率

2.2 不同年份中, PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗体阳性率检测

从2014年到2016年上半年, 采集台州地区规模猪场血液分别为815份, 1 753份和469份。分别进行PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗体检测。检测结果(图2)显示, 从2014年到2016年, PRRSV和PCV2抗体阳性率变化不大, PRRSV保持在65%以上, PCV2抗体阳性率一直处于高位, 在90%以上; CSFV抗体阳性率逐年提高, 从2014年的64.9%逐渐上升到2016年的80.4%; PRV gE抗体阳性率逐年下降, 从2014年的52.5%逐渐下降到2016年的22.9%。

图2 2014— 2016年猪血清中PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗体阳性率比较

2.3 不同年龄段猪群中, PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗体阳性率检测

按照猪群的年龄段划分为母猪、仔猪、保育猪和肥育猪, 其中母猪776份、仔猪211份、保育猪467份、肥育猪436份。检测结果(图3)显示, 不同年龄段猪群中, PRRSV和CSFV的抗体阳性率出现较一致的变化趋势, 母猪抗体水平最高, 仔猪抗体水平逐渐下降, 保育猪最低, 抗体阳性率下降到50%以下, 肥育猪阶段又有所回升; PCV2的抗体阳性率一直都处于较高水平, 保育阶段虽有所下降, 也能维持在80%左右。PRV gE在母猪和仔猪阶段抗体阳性率相对较高, 在30%~40%, 而在保育猪和肥育猪阶段抗体阳性率较低, 均维持在20%以下。

图3 不同年龄段猪群中, PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗体阳性率比较

3 讨论

台州位于浙江省的东南沿海, 三面环山, 资源丰富, 水路发达, 但当地生猪养殖量少, 供给主要依靠山东、河南、安徽等地的调入。近些年, 在当地政府的扶持下, 一批规模化养猪场逐渐发展起来, 解决了当地百姓的就业问题。生猪养殖的增加以及交易的日益频繁, 同时猪疫病也随之增加, 特别是猪的病毒性疫病, 发病急, 死亡率高, 给养殖户带来很大的经济压力。其中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等疾病是台州地区养猪业最主要也是最常见的猪病毒性疫病。有资料显示, PRRSV和PCV2可以侵害猪的免疫器官和免疫细胞, 造成猪群免疫系统的破坏, 导致猪瘟等疫苗免疫抑制或失败, 猪群抗体水平整体下降, 更加易感猪瘟野毒等病原微生物。

从病原检测结果看, PRRSV、CSFV、PCV2及PRV4种病毒病在台州地区不同程度的存在并流行, 其中2014年PCV2检出率高达60%, PRRSV检出率为41.9%, SFV检出率为19.23%。在PCV2感染普遍的情况下, PRRSV引起猪免疫抑制性疫病也增多, 可能会导致猪瘟免疫的失败。

从血清抗体监测结果看, PRRSV、CSFV、PCV2的抗体水平变化较一致, 其中母猪的抗体水平均较高, 仔猪抗体水平有所回落, 而保育阶段抗体水平最低, 到育肥阶段抗体水平均有不同程度的提高。具体分析可能是因为仔猪母源抗体水平较高, 而育肥猪因为猪只体重增加, 抵抗力增强、疫苗免疫次数多等因素有关。这与猪场在保育猪阶段猪群容易发病, 死亡率也较其它阶段高的情况相符合。

本次调查的规模猪场均接种了 PRV gE基因缺失疫苗, 而实验中采用的猪伪狂犬病毒gpI(gE)抗体检测试剂盒, 其监测的PRV抗体为猪只感染猪伪狂犬野毒后产生的抗体, 即PRV gE抗体。gE抗体阳性率越高, 说明猪群感染猪伪狂犬野毒越严重[5]。2014年到2016年台州地区PRV gE抗体从52.5%下降到22.9%, 说明该地区猪伪狂犬病在猪群中持续存在, 但感染率有明显下降趋势。

从近3年的调查结果来看, 在台州地区PRRSV、CSFV、PCV2及PRV存在不同程度流行的态势下, 对规模猪场最有效也是最实用的手段是选用优质的疫苗, 并制定科学合理的免疫计划, 进行疫苗免疫。同时每季度定期对猪群进行抗体的监测, 按照检测数据具体分析猪场的实际情况, 及时调整免疫程序, 同时补免个别漏打猪及淘汰多次免疫不合格猪, 以保证猪群有足够的免疫力。另外, 猪场还需要加强管理和生物安全措施, 防止病毒的入侵。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献:
[1] 陆承平. 兽医微生物学[M]. 4版. 北京: 中国农业出版社, 2007: 358. [本文引用:1]
[2] HARMS P A, HALBUR P G, SORDEN S D, et al. Three cases of porcine respiratory disease complex associated with porcine circovirus type 2 infection[J]. Journal of Swine Health and Production, 2002, 10(1): 27-30. [本文引用:1]
[3] 舒相华, 尹革芬, 杨志雷, 等. 云南地区部分猪场猪呼吸道疾病综合症(PRDC)患病猪群中PRRSV, PCV-2, CSFV, PRV混合感染调查[J]. 云南农业大学学报, 2011, 26(1): 54-58. [本文引用:2]
[4] 左奕, 王建永, 袁万哲, 等. PCV2-PRV-PRRSV-CSFV多重PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学, 2015, 45(8): 771-775. [本文引用:1]
[5] 党占国, 庄金山, 晋春霞, 等. 2012—2015年河南省部分地区规模化猪场PRV血清流行病学调查[J]. 国外畜牧学: 猪与禽, 2016(1): 44-47. [本文引用:1]