引用本文
唐兴国, 王伯诚, 赖小芳. 天麻共生蜜环菌液体种培养基的优化[J]. 浙江农业科学, 2017,(4):635-637  
Permissions
Copyright©2017, 《浙江农业科学》编辑部
《浙江农业科学》编辑部 所有
天麻共生蜜环菌液体种培养基的优化
唐兴国, 王伯诚, 赖小芳
台州市农业科学研究院,浙江 临海 317000

作者简介:唐兴国(1979—),男,湖北宜昌人,农艺师,硕士,从事珍稀药用植物与药用菌的开发及应用研究工作,E-mail:ahgotang@hotmail.com。

基金项目: 台州市市级科技资金项目(131KY23)
摘要

在传统蜜环菌母种培养基(加富PDA)基础上,通过正交试验获得一种蜜环菌液体种改良培养基配方(栎树枝100 g·L-1,毛竹根50 g·L-1,蔗糖20 g·L-1,马铃薯200 g·L-1,KH2PO4 3 g·L-1,MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1,VB1 10 mg·L-1,pH自然)。在此培养基上培养的蜜环菌菌球个体更大,菌丝体活力更强,培养14 d后蜜环菌菌丝体产量可达0.803 2 g·100 mL-1,为原配方的2.98倍。

关键词: 蜜环菌; 天麻; 摇瓶培养; 培养基
中图分类号:S646.2 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2017)04-0635-03 doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20170428

蜜环菌(Armillaria mellea)是一种药食兼用菌[1], 与药用植物天麻(Gastrodia elata)和真菌猪苓(Polyporus umbellatus)相伴生[2], 蜜环菌是天麻无性繁殖阶段的唯一营养源[1]。在生产上, 天麻种植用蜜环菌菌种分为母种(一级)、原种(二级)和栽培种(三级)。从野生环境中分离纯化得到的母种经扩大培养成为生长旺盛的原种, 原种接种于固体培养基形成用于生产的栽培种。菌种质量的好坏直接影响生产中菌材菌索的数量及健壮程度, 而后者则决定了天麻的质量和产量[3]。

目前生产上常用固体加富PDA培养基培养母种, 其缺点是菌丝易于老化、菌索细弱长势较差[4]。原种则多采用固体木屑培养基或液体加富PDA培养基[1, 3], 固体木屑培养基培育的原种质量较好, 但是培养基配制繁琐, 培养周期偏长[5, 6]; 液体加富PDA培养基上培养的蜜环菌长势一般, 难以满足生产用种需要。目前有关蜜环菌液体培养方面的研究主要集中于工业发酵领域, 研究所得的培养基和培养条件并不适合在天麻种植中推广应用[7, 8]。本试验拟在前人工作基础上对蜜环菌摇瓶液体种培养基进一步优化, 以期筛选出菌丝体性状优良且高产的液体种培养基配方。

蜜环菌在自然界最常见的宿主为壳斗目阔叶硬质杂木, 包括麻栎、青冈栎、栗树等[1, 3]。长期以来, 人们在生产上也主要选择栎树作为基材培育蜜环菌[1, 3, 5, 6], 进而人工栽培天麻。因此, 考虑向培养基中加入栎树枝浸提液进行优化。此外, 笔者在生产实践中观察到, 蜜环菌对毛竹根有较强的附着腐生能力, 故考虑在培养基中加入毛竹根浸提液进行培养试验, 期望通过研究证实毛竹根在蜜环菌生长中的营养支持作用, 为用毛竹替代传统基材进行蜜环菌培育和天麻栽培积累经验。

1 材料与方法
1.1 材料

供试菌种。蜜环菌(Armillaria mellea)母种, 采集于浙江省仙居县朱溪镇山后陈村天麻原生地, 分离纯化后保存在加富PDA培养基上待用。

试管种扩繁培养基[3]。马铃薯200 g· L-1, 葡萄糖20 g· L-1, 琼脂18 g· L-1, KH2PO4 3 g· L-1, MgSO4· 7H2O 1.5 g· L-1, VB1 10 mg· L-1。

摇瓶液体母种培养基[3]。马铃薯200 g· L-1, 葡萄糖20 g· L-1, KH2PO4 3 g· L-1, MgSO4· 7H2O 1.5 g· L-1, VB1 10 mg· L-1, pH自然。

1.2 处理设计

试管种扩大培养。将试管原种切成0.5 cm× 0.5 cm的方块, 接入试管种扩繁培养基斜面, 28 ℃暗培养, 待菌丝长满后留作母种。

摇瓶液体母种的制备[9]。将试管母种切成0.5 cm× 0.5 cm的方块, 接入摇瓶液体母种培养基, 250 mL三角瓶每瓶装入培养基100 mL, 接种量4块。接种后于28 ℃避光静置24 h, 待菌丝修复后, 避光条件下28 ℃、120 r· min-1摇瓶培养3~5 d, 至菌液呈浅红色, 即制得摇瓶液体母种。

二级摇瓶培养基的筛选。采用正交设计对液体母种培养基进行优化, 在原培养基基础上加入栎树枝和毛竹根浸提液, 并改变碳源种类及马铃薯用量, 各因素水平组合见表1。

摇瓶培养的其他参数设置。装液量100 mL/250 mL, 接种量5 mL/100 mL, 摇床转速120 r· min-1, 28 ℃暗培养14 d[10, 11]。

菌丝生物量测定。发酵结束后真空抽滤收集菌丝体, 温水冲洗除去附着在菌索上的培养基[9], 65 ℃烘干至恒质量, 测量菌丝体干质量(g· 100 mL-1)。

L9(34)因素水平。1~3水平, 因素A(栎树枝)分别为0、50和100 g· L-1, B(毛竹根)分别为0、50和100 g· L-1, C(碳源)分别为葡萄糖20 g· L-1, 蔗糖20 g· L-1, 果糖20 g· L-1, D(马铃薯)分别为50、100和200 g· L-1。实验中各种不溶性固体添加物均采用浸提液, 具体操作程序:去皮去杂→ 定量称取→ 清水煮沸40 min→ 6层纱布过滤→ 滤液全部加入培养基中。

1.3 数据处理

实验数据全部运用SPSS 17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析
2.1 二级摇瓶培养基的正交试验优化

从表1可以看出, A、B、C、D对蜜环菌菌丝体生物量的影响R值分别为0.382 4、0.082 0、0.108 0、0.141 6 g· 100 mL-1。因此, 各因素对菌丝体生物量的影响大小次序为栎树枝> 马铃薯> 碳源> 毛竹根。

表1 蜜环菌液体发酵各因素水平下的菌丝体干质量

方差分析结果显示, 栎树枝的F=87.370, P=0< 0.01; 毛竹根的F=4.947, P=0.013< 0.05; 碳源的F=6.703, P=0.003< 0.01; 马铃薯的F=13.731, P=0< 0.01。这表明试验中栎树枝、碳源和马铃薯对蜜环菌菌丝体生物量的影响均达到了极显著水平, 而毛竹根对蜜环菌菌丝体生物量的影响也达到了显著水平。因此, 需要进一步进行各因素水平间的多重比较以了解其具体差异。

由表2可以看出, 栎树枝的3个水平之间的差异均达到极显著水平; 毛竹根的水平2与水平1、3之间的差异达到显著水平, 但水平1与水平3之间没有显著差异; 碳源的水平1与水平3之间的差异达到极显著水平, 水平2与水平3之间的差异也达到显著水平, 但水平1与水平2之间没有显著差异; 马铃薯的水平3与水平1、2之间的差异达到极显著水平, 但水平1与水平2之间没有显著差异。这说明在蜜环菌液体发酵过程中, 选择葡萄糖或蔗糖作为碳源, 并向培养基中添加较高水平的栎树枝和马铃薯浸提液, 同时添加适量毛竹根浸提液将有利于蜜环菌菌丝体生物量的积累。实验筛选出的优化培养基组合为A3B2C1D3, 即实验中的处理8。由于葡萄糖与蔗糖在本实验中并未表现出较显著差异, 因此, 考虑以成本较低廉的蔗糖替代葡萄糖作为碳源, 故最终确定的优化组合为A3B2C2D3。

表2 各因素水平间的差异显著性
2.2 优化后的二级摇瓶培养基与常规加富PDA培养基的比较

常规加富PDA培养基:马铃薯200 g· L-1, 葡萄糖20 g· L-1, KH2PO4 3 g· L-1, MgSO4· 7H2O 1.5 g· L-1, VB1 10 mg· L-1, pH自然。

优化后的二级摇瓶培养基:栎树枝100 g· L-1, 毛竹根50 g· L-1, 蔗糖20 g· L-1, 马铃薯200 g· L-1, KH2PO4 3 g· L-1, MgSO4· 7H2O 1.5 g· L-1, VB1 10 mg· L-1, pH自然。

将同一批摇瓶液体母种分别接入上述2种培养基进行摇瓶培养, 装液量100 mL/250 mL、接种量5 mL/100 mL、摇床转速120 r· min-1、28 ℃暗培养14 d。发酵结束后统计菌丝体生物量。结果显示:优化后的二级摇瓶培养基和常规加富PDA培养基上的蜜环菌菌丝体生物量分别为0.803 2和0.269 8 g· 100 mL-1, 菌球直径分别为3~5和1~3 mm, 颜色分别为黄褐色和淡黄色。另外, 优化后的二级摇瓶培养基中蜜环菌菌球数目更多, 个体更大, 同时部分菌球表面有清晰可见的菌索状突起, 这表明在此条件下培养的蜜环菌菌丝体生长旺盛、活力更强[9]。

3 小结与讨论

本试验筛选出了新的摇瓶培养基配方:栎树枝100 g· L-1, 毛竹根50 g· L-1, 蔗糖20 g· L-1, 马铃薯200 g· L-1, KH2PO4 3 g· L-1, MgSO4· 7H2O 1.5 g· L-1, VB1 10 mg· L-1, pH自然。蜜环菌在此培养基上摇瓶培养(装液量100 mL/250 mL、接种量5 mL/100 mL、摇床转速120 r· min-1、28 ℃暗培养)14 d, 菌丝体生物量可达0.803 2 g· 100 mL-1, 为常规加富PDA培养基的2.98倍, 而且在此培养基上摇瓶培养的蜜环菌菌丝体生长旺盛、活力更强。

本试验通过正交设计对蜜环菌摇瓶液体母种培养基进行了优化, 在常规加富PDA培养基的基础上引入了栎树枝浸提液、毛竹根浸提液2种附加成分, 并尝试改用不同碳源进行培养试验。试验初步证实, 在蜜环菌摇瓶培养过程中, 向培养基中添加较高水平的栎树枝和马铃薯浸提液, 同时添加适量毛竹根浸提液有利于蜜环菌菌丝体生物量的积累。栎树枝和马铃薯2种天然附加物对蜜环菌的生长起到了重要的营养支持作用, 这与前人的研究[8, 9]以及生产实践中观察到的现象一致。试验中还观察到, 添加毛竹根浸提液对蜜环菌生物量的积累具有正向促进作用, 但这种正向促进作用并没有随着添加量的增加而提升。目前同类研究中尚未见到相关报道, 其作用机理有待进一步深入研究。从本次试验的效果来看, 尚不能确认毛竹根可否作为蜜环菌培育的主要基材, 需要在后续工作中进一步证实。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献:
[1] 徐锦堂, 冉砚珠. 中国天麻栽培学[M]. 北京: 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1993. [本文引用:5]
[2] 王秋颖, 郭顺星, 樊锦艳. 不同蜜环菌菌株生物学特性及菌丝体多糖含量的研究[J]. 中国药学杂志, 2001, 36(9): 588-589. [本文引用:1]
[3] 兰进, 徐锦堂, 陈向东. 天麻栽培技术百问百答 [M]. 2版. 北京: 中国农业出版社, 2009. [本文引用:6]
[4] 熊鹰, 姜邻, 唐利民. 蜜环菌母种培养基筛选试验[J]. 中国食用菌, 2004, 23(5): 25-26. [本文引用:1]
[5] 吴连举, 关一鸣, 王英平. 天麻标准化生产与加工利用一学就会[M]. 北京: 化学工业出版社, 2013. [本文引用:2]
[6] 周昌华, 韦会平. 天麻栽培技术(修订版)[M]. 北京: 金盾出版社, 2004. [本文引用:2]
[7] 秦国夫, 赵俊, 郭文辉, 等. 蜜环菌的生物学研究进展[J]. 东北林业大学学报, 2004, 32(6): 89-94. [本文引用:1]
[8] 程显好, 刘林德, 董洪新, 等. 蜜环菌菌丝体液体培养条件的优化[J]. 中药材, 2007, 30(5): 509-512. [本文引用:2]
[9] 刘冰, 牛芸, 张德著, 等. 天麻共生蜜环菌母种及液体种培养基的优化[J]. 中国食用菌, 2012, 31(3): 28-31. [本文引用:4]
[10] 张翠霞, 孟庆国, 冯华, 等. 食用菌液体菌种在生产和使用中应注意的问题[J]. 中国食用菌, 2004, 23(4): 49-50. [本文引用:1]
[11] 陶文沂, 敖宗华, 许泓瑜, 等. 药食用真菌生物技术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2007. [本文引用:1]