供试燕麦种子由吕梁学院生物实验室提供, 保存于4 ℃冰箱内。5个品种分别是定燕1号、白燕2号、宁莜1号、晋燕17号和晋燕8号。

主要试剂有无水乙醇、氯仿、异戊醇、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、氯化钠、2-巯基乙醇、浓盐酸、氢氧化钠、蒸馏水等。

主要仪器有HH-6型数显恒温水浴锅、Neofuge13R型台式高速冷冻离心机、UV-1601双光束紫外/可见分光光度计、超低温冰箱、pH值试纸、玻璃棒、移液器、研钵、1.5 mL的离心管、电子天平、微波炉。

1.2.1 提取DNA的方法与步骤

采取CTAB法对燕麦基因组DNA进行提取。植物材料经过粉碎, 提取液中的阳离子去垢剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)能够溶解细胞膜和核膜, 解聚核蛋白, 且与DNA形成复合物。在高盐条件下, 该复合物是可溶的^[9]。用氯仿等有机溶剂抽提可使蛋白质变性, 使多糖沉淀, 经过离心, CTAB-DNA复合物仍留在上清液中; 降低盐浓度, 则CTAB-DNA复合物发生沉淀, 沉淀用高盐TE缓冲液溶解后, 加入无水乙醇, CTAB仍留在溶液中, 但DNA发生沉淀, 沉淀溶于TE缓冲液中, 即可得到植物基因组DNA^[9]。

1.2.2 备用试剂的配制

氯仿/异戊醇。按照体积比24∶ 1的比例配制即可, 在4 ℃下保存备用。

CTAB/NaCl溶液。4.1 g NaCl溶解于80 mL蒸馏水中, 缓缓加入10 g CTAB, 边加热边搅拌至溶解, 用蒸馏水定容至100 mL。

TE缓冲液。10 mL 0.01 mol· L^-1pH值8.0的Tris-HCl和40 mL 0.001 mol· L^-1 pH值8.0的EDTA混合, 加入蒸馏水定容至100 mL, 配制成TE缓冲液。

pH值8.0 Tris-HCl。50 mL 0.2 mol· L^-1的Tris加26.8 mL的0.2 mol· L^-1的HCl, 定容至200 mL。

pH值8.0 CTAB提取液。2 g CTAB加蒸馏水40 mL, 加0.1 mol· L^-1Tris-HCl(pH值8.0)10 mL、0.5 mol· L^-1EDTA(pH值8.0)4 mL和5 mol· L^-1NaCl 28 mL, 待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100 mL。

1.2.3 DNA的提取

燕麦种子在清水中浸泡后除去外壳, 放在预冷的研钵内迅速磨碎, 用电子天平称取0.1 g燕麦种子粉末, 转入1.5 mL无菌离心管。

将一定量CTAB提取液中加入2-硫基乙醇至终体积分数的2%, 在水浴锅中加温至65 ℃。然后向上述装有燕麦种子粉末的离心管中加入600 μ L的预热CTAB提取液, 在65 ℃的水浴锅中保温30 min, 期间不断摇晃离心管。

向上述离心管中加入500 μ L的氯仿/异戊醇, 颠倒离心管数次, 然后在4 ℃, 11 000 r· min^-1下离心10 min, 取上清液转移到另一个离心管中。

向上清液中加入1/10体积的CTAB/NaCl溶液并预热到65 ℃, 颠倒离心管数次。再向离心管中加入相同体积的氯仿/异戊醇, 晃动离心管几次。室温, 11 000 r· min^-1下离心10 min, 用移液管吸取上清液转移到另一个离心管中。

然后再加入等体积的氯仿/异戊醇, 相同条件下重复离心几次, 直到中间没有白色物质, 取上清到一个无菌离心管中。

向上述离心管中加入2倍体积的无水乙醇, -20 ℃下静置30 min。

在4 ℃条件下, 14 000 r· min^-1离心15 min, 弃上清, 留下沉淀物。

沉淀用75%的乙醇润洗1次, 室温干燥, 用TE缓冲液溶解沉淀, 得到DNA溶液, 在-20 ℃下保存备用。

叶片DNA的提取方法和步骤与种子基本一样。

核酸之所以具有紫外吸收的性质, 是因为其碱基均具有共轭双键。核酸在260~290 nm处有较强吸收峰, 在260 nm处吸收值最大, 230 nm吸收值最小; 蛋白质在280 nm处吸收值最大。因此可以根据所测定样品的D₂₆₀/D₂₈₀的比值来判断提取的DNA的纯度。

在紫外分光光度计上分别设置260、280 nm两个波长, 用TE缓冲液进行空白对照, 对每种燕麦提取的基因组DNA溶液进行吸光度测定, 并计算D₂₆₀/D₂₈₀。