水产用阿维菌素聚乳酸微球的制备工艺
戴瑜来, 许宝青, 张乐, 林启存, 戴杨鑫, 马恒甲, 蔡丽娟, 朱丽敏
杭州市农业科学研究院,浙江 杭州 310024

作者简介:戴瑜来(1986—),男,浙江奉化人,工程师,从事水产病害防治与水域环境监测研究工作,E-mail:dylaiuai@163.com

摘要

为了优化阿维菌素聚乳酸微球的制备工艺,形成契合水产养殖需求的微球制备工艺。采用乳化-溶剂挥发法制备微球,以微球粒径和包封率为评价指标,通过正交试验对处方和工艺进行优化,并对微球在养殖水体中的释放情况进行了考察。结果所得微球外观形态良好,粒径在50~80 μm,包封率达72.6%,64 h药物累计释放率少于60%。相对于原药在水体中4 h 100%溶出,阿维菌素聚乳酸微球具有显著的缓释作用。

关键词: 阿维菌素; 水产用; 聚乳酸; 缓释
中图分类号:TS254 文献标志码:B 文章编号:0528-9017(2017)05-0858-03 doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20170543
Abstract
Keyword:

阿维菌素(avermectin)是一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯类化合物, 由于其作用机制独特, 用量小, 驱虫效果好, 被广泛应用于农业、畜牧业和水产养殖业中, 并取得了巨大的经济社会效益[1]

阿维菌素常规剂型有片剂、粉剂、乳剂、糊剂、透皮剂、口服液、注射液等[2], 水产上常用的是粉剂和乳剂。阿维菌素的常规剂型极易光分解氧化, 导致其光稳定性差, 泼洒使用持效期短, 无形中增加了渔民用药次数和防治成本[3]。此外, 常规剂型存在有效成分达峰快、峰值高和有效抗虫浓度持续时间短等缺陷, 易引起养殖动物急性毒性反应, 且导致药物抗虫效果不佳。

上述问题在较大程度上是由于常规药物的加工剂型、使用方法和对象的不合理造成的, 将现有药物品种的配方及剂型进行改进是目前药物研发的主要方向, 相对于开发新药物具有更好的成效和更低的成本。缓释制剂是指用常规药物与载体材料、辅料制成持续稳定释放的剂型, 它可根据病害发生规律、特点及环境条件, 使药物按照需要的剂量、特定的时间、持续稳定地释放, 以达到经济、安全、有效地控制病害。目前, 在农林牧业中使用阿维菌素缓释制剂已有相关研究, 并取得较好使用效果, 但应用于水产上的阿维菌素缓释制剂却鲜有报道。

本研究选用无污染、可降解材料聚乳酸作为辅材, 通过乳化-溶剂挥发制成阿维菌素缓释制剂, 并对其形态特征、粒径大小及养殖水体的释药情况进行研究, 旨在为阿维菌素缓释制剂应用于水产提供理论基础。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 仪器

Waters Alliance e2695高效液相色谱仪(美国沃特世); FA2204B电子分析天平(上海精科实业有限公司); Olympus BX53显微镜(奥林巴斯有限公司); S-3400N型扫描电子显微镜(日本HITACHI); RS-360E超声波清洗仪(上海华岩仪器设备有限公司); DSX电动搅拌机(杭州仪表电机有限公司); HS-2恒温水浴锅(太仓市华利达实验设备有限公司)。

1.1.2 药物与试剂

阿维菌素标准品, 纯度95.0%, 德国DR.Ehrenstorfer公司; 阿维菌素原药, 纯度98.0%, 浙江盛通科技有限公司; 聚乙烯醇124为优级纯, 二氯甲烷、甲醇、吐温80等为分析纯, 均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 处理设计

为了优化制备工艺, 根据预实验结果, 将聚乳酸浓度(A)、聚乙烯醇浓度(B)、给药量(C)、搅拌速率(D)确定为试验影响因素, 每个因素选1~3个水平, 分别为A 2%、3%和4%, B 0.6%、0.8%和1.0%, C 0.75、1.00和1.25 g, D 300、400和500 r· min-1。根据L9(34)正交表设计安排试验。

1.2.2 制备方法

采用O/W(油相/水相)乳化-溶剂挥发法制备。分别称取一定量原药阿维菌素和聚乳酸搅拌溶于二氯甲烷中组成分散相(共25 mL); 聚乙烯醇(连续相稳定剂)加热溶解于蒸馏水中(共250 mL), 将分散相缓慢加入到连续相中, 以一定搅拌速率搅拌形成油-水乳剂, 至乳滴固化形成球状体后升高系统温度到45 ℃, 降低搅拌速率, 直至有机溶剂挥发停止搅拌, 静置后, 过滤得到固体微粒, 经蒸馏水洗涤3次, 干燥后贮存备用[4]

1.3 主要性能测定

1.3.1 形态观察

光学显微镜观察。用去离子水将一定量的微球粉末配制成悬浮液后, 滴于载玻片上, 用光学显微镜观察微球形态、粒径大小, 并选取有代表性的区域进行拍照。

电镜观察。将微球首先进行喷金处理, 以扫描电子显微镜观察微球的整体形态和单个微球的表面状态。

1.3.2 质量浓度检测

以高效液相色谱法(HPLC)为检测方法。色谱条件为:C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm× 5 μ m), 柱温35 ℃, 流动相为甲醇-水(85∶ 15), 流速1.0 mL· min-1, 进样量10 μ L, 紫外检测波长245 nm。

标准曲线制作。准确称取12.5 mg阿维菌素对照品至25 mL容量瓶, 用甲醇溶解定容。分别吸取适量, 用甲醇稀释, 制成含阿维菌素为0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μ g· mL-1的标准溶液。各取10 μ L, 用HPLC分析, 制成标准曲线。

1.3.3 载药量和包封率测定

准确称取0.05 g微球, 用二氯甲烷溶解后, 再用甲醇定容至25 mL, 稀释10倍后经0.22 μ m滤膜过滤, 用高效液相色谱(HPLC)测定滤液中阿维菌素含量。

载药量/%=微球中阿维菌素的质量÷ 微球的总质量× 100;

包封率/%=微球中阿维菌素的质量÷ 实际加入阿维菌素的质量× 100。

1.3.4 养殖水体中药物溶出测定

分别称取等量原药和缓释微球(以阿维菌素量计), 先经乳化剂(吐温80)乳化后, 稀释泼洒于养殖水体(2 m× 2 m水泥池, 水体深1 m), 分别在0.5、1、2、4、8、16、32、64 h取样(每次取1 L, 取样后加入等量养殖水), 装瓶后待处理。试验分别设有2个平行组。

1.3.5 水样处理

将1 L水样用3× 50 mL二氯甲烷萃取, 经无水硫酸钠过滤后在旋转蒸发仪上浓缩至1~2 mL, 然后用高纯氮吹干, 色谱甲醇定容至5 mL后待测[5]

2 结果与分析
2.1 标准曲线

不同浓度阿维菌素的标准溶液经高效液相色谱上机分析后, 以色谱峰面积为横坐标、进样质量浓度为纵坐标作标准曲线, 得标准曲线为A=1.84× 104C+6.85× 103, r=0.999 9。

2.2 正交设计结果

表1结果可见, 正交设计最佳制备工艺条件是A3B2C1D2, 即聚乳酸浓度为4.0%、聚乙烯醇浓度为0.8%、给药量为0.75 g、搅拌速率为400 r· min-1; 从极差大小判断, 四因素对包封率的影响程度由大到小依次为A> C> B> D。因为最佳工艺未在正交试验表中, 根据最佳工艺试验制备微球, 并测其包封率为72.6%, 载药量达54.8%。

表1 制剂工艺优化正交试验
2.3 微球表征观察

由图1可看出, 微球粒径在50~80 μ m, 分散均匀, 形态均一, 球形度较好。

图1 最佳制备工艺条件下的微球

2.4 养殖水体中药物溶出结果

由图2可知, 原药的溶出速度最快, 到试验4 h已经完全溶出, 而各组微球均具有良好的缓释性能, 到试验结束(64 h)释放均不超过60%的药量; 最优制备条件下制得的微球缓释效果除略小于试验组6外, 均好于其他试验组。图中显示, 阿维菌素微球均存在突释和缓释2个阶段, 前1 h表现出突释效应, 到8 h左右处出现缓释平台。

图2 正交组、最优工艺、原药在养殖水体中的释放曲线

3 小结与讨论

制备微球的方法主要有乳化-溶剂挥发法、相分离法、乳化溶剂萃取法、喷雾干燥法、熔融法等, 其中乳化溶剂挥发法最为常用[6]。该方法制备微球与药物性质、挥发性溶剂、乳化剂种类、搅拌速率、仪器设备、聚合物在分散中的浓度等有关[7, 8]。本研究所选药物为脂溶性药物, 在水中几乎不溶(10 μ g· L-1), 非常适用于O/W乳化-溶剂挥法制备载药微球[9]。为了获得最佳工艺条件, 本试验在单因素考察的基础上, 研究了辅料浓度、投药量、乳化剂浓度、搅拌速率对微球质量的影响, 所制得的微球形态均一、球形度好, 在养殖水体中具有较好的缓释效果。

突释现象是药物较难解决的问题, 突释效应可造成短时间内释放出大量的药物, 使体内的血药水平陡然升高, 产生不良反应[9]。本研究发现, 原药和微球的溶出过程中均存在突释现象, 微球药物中的原药虽然被辅料填充在材料内, 但仍存在突释现象, 其原因可能是微球表面粘附原药或微球干燥时药物向微球表面迁移富集引起[10]。然而, 微球药物的突释效应要远小于阿维菌素原药, 因此, 使用微球药物较原药具有更高的安全性。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献:
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