石斛灰霉病病样采集于浙江乐清、新昌、建德、富阳、龙游等地; 采样后将标样稍作阴干, 置于信封中带回实验室分离。

用PDA培养基进行常规组织分离, 于25 ℃培养纯化获得菌株。人工接种后, 采集病样, 经相同方法分离获得菌株^[6]。

选取分离物FD13-12, 观测其主要培养性状。将分离物接种于PDA培养基, 25 ℃培养20 d, 记录菌落形态、颜色和子实体产生情况; 测量100个分生孢子的大小, 重复3次, 计算平均值^[6]。

选取FD13-12等10株分离物进行致病性测定。各供试分离物在PDA培养基上培养产生分生孢子, 用毛笔刷取孢子并与0.1% CMC-Na水溶液混合均匀制成菌悬液, 用0.1% CMC-Na水溶液稀释菌悬液至其含菌量为10⁶· mL^-1, 该菌悬液是本试验用的接种体。

离体接种试验。摘取外观健康的石斛中位叶(除去心叶及其下一位叶和末位叶)进行试验。在直径90 mm培养皿底垫3层用无菌水浸湿的滤纸, 随机取叶片排放在滤纸上, 在每片叶的两端盖上湿的脱脂棉, 每皿5叶。伤口接种试验处理在叶片中央用针头穿刺1个小孔。在每张叶片中央滴加20 μ L接种体菌悬液, 每个分离物无伤口和有伤口接种试验均涂6个培养皿共30片叶; 对照用清水涂布叶片。将接种处理培养皿置28 ℃、5 000 lx光照生化培养箱内, 观察并记录发病情况。

盆栽接种试验。取健康中位叶用印泥标记作接种叶, 用毛笔将接种体菌悬液均匀涂布在接种叶上, 每个分离物无伤口和有伤口接种试验均涂100个叶片; 对照用清水涂布叶片。接种处理的植株在湿布围成的保湿棚中保湿48 h后移去保湿棚, 7 d后观察记录发病情况。每个病原分离物接种处理均采3片病叶, 采用1.2节方法分离病原物, 采用1.3节方法对新分离物与原分离物进行性状对比。

灰霉病主要侵染铁皮石斛的叶片及嫩茎。叶片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小点, 后小点渐渐扩大, 有时呈轮纹状, 病斑与绿色叶片的病健交界处常有褐色至深褐色的晕圈; 病斑圆形或椭圆形, 淡褐色至黑褐色, 中间凹陷, 最大病斑可达铁皮石斛叶片的边缘。深秋、冬季和早春石斛发病后叶片常发黄, 或枯死, 或脱落。发黄的石斛病叶常常带有橘红色, 而其上病斑则呈淡褐色至黑褐色, 病斑与发黄叶部交界处常常有或深或浅的绿色晕圈; 病斑上, 尤其是病斑中心常长有灰褐色的霉层, 即病原菌的分生孢子。这些发黄的石斛病叶轻轻碰触, 即可脱落。在深秋、冬季和早春田间湿度高时, 叶片、嫩梢以及枯黄的叶片有时会出现大量水渍状的湿腐, 并在病斑上产生大量的灰褐色的霉层, 即病原菌的分生孢子(图1)。

图1

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	图1 铁皮石斛灰霉病为害症状左上图为褐色至深褐色的晕圈; 右上图为或深或浅的绿色晕圈; 左下图为水渍状的湿腐; 右下图为分生孢子

培养基上菌落圆形、白色, 营养菌丝半透明、稀疏, 气生菌丝较少。培养4 d后菌落直径达到45 mm, 培养11 d左右中间部位呈现灰色, 后期出现黑色不规则菌核。

该菌较易产生分生孢子, 其产孢量较大。分生孢子单胞, 圆形或椭圆形, 无色至淡灰褐色, 大小7.5~10.8 μ m × 4.8~9.6 μ m, 成簇聚生于分生孢子梗末端的膨大部。分生孢子梗丛生, 直立或稍弯曲, 大小192.5~387.6 μ m× 9.7~13.4 μ m, 淡褐色有隔膜。经鉴定, 该真菌属半知菌亚门丛梗孢目丛梗孢科葡萄孢属灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea Pers.ex Fr.)。

从2013— 2014年采自温州乐清、绍兴新昌、杭州建德、杭州富阳、衢州龙游等病样分离物中, 选取10株分离物进行离体试验和盆栽试验测定其致病性。离体接种试验结果显示, 10株供试分离物均对石斛叶片致病, 无伤口接种的叶发病率86.7%~96.7%, 有伤口接种的叶发病率90.0%~100%。采集自不同地区的分离物致病性有一定差异(表1)。

表1

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表1 浙江各石斛产区灰葡萄孢霉分离物致病力测定(离体试验) 病原 分离物 来源 叶发病率/% 采样年份 采样地点 无伤口 有伤口 FD13-12 2013 温州乐清 96.7 100.0 FD14-07 2014 温州乐清 93.3 100.0 FD13-05 2013 绍兴新昌 86.7 96.7 FD14-13 2014 绍兴新昌 93.3 100.0 FD13-15 2013 杭州建德 86.7 90.0 FD14-18 2014 杭州建德 90.0 93.3 FD13-15 2013 杭州富阳 94.3 100.0 FD14-18 2014 杭州富阳 95.7 100.0 FD13-15 2013 衢州龙游 91.2 96.7 FD14-18 2014 衢州龙游 93.3 100.0 清水 — — 0 0

表1 浙江各石斛产区灰葡萄孢霉分离物致病力测定(离体试验)

盆栽接种试验结果显示, 10株供试分离物均对石斛叶片致病, 无伤口接种的叶发病率80%~91%, 有伤口接种的叶发病率84%~100%, 有伤口接种的叶发病率高于无伤口接种, 采集自不同地区的分离物致病性有一定差异(表2)。每个分离物接种处理均采3片病叶, 从中均能分离到灰葡萄孢霉。该灰葡萄孢霉分离物与原用于接种的灰葡萄孢霉分离物在PDA培养基上的培养性状和繁殖体形态特征相同, 说明2种分离物是同一分离物。

表2

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表2 浙江各石斛产区灰葡萄孢霉分离物致病力测定(盆栽试验) 病原 分离物 分离物来源 叶发病率/% 采样年份 采样地点 无伤口 有伤口 FD13-12 2013 温州乐清 91 100 FD14-07 2014 温州乐清 90 100 FD13-05 2013 绍兴新昌 82 91 FD14-13 2014 绍兴新昌 89 100 FD13-15 2013 杭州建德 80 87 FD14-18 2014 杭州建德 81 84 FD13-15 2013 杭州富阳 87 100 FD14-18 2014 杭州富阳 83 100 FD13-15 2013 衢州龙游 91 100 FD14-18 2014 衢州龙游 89 100 清水 — — 0 0

表2 浙江各石斛产区灰葡萄孢霉分离物致病力测定(盆栽试验)

根据对石斛灰霉病分离物的培养性状和形态特征观测, 参照魏景超等^{[7, 8, 9]}的描述, 石斛灰霉病的分离物被鉴定为灰葡萄孢霉, 属半知菌亚门、丛梗孢目、丛梗孢科、葡萄孢属。

从石斛灰霉病病样中分离到灰葡萄孢霉, 用该分离物成功诱发出灰霉病, 从诱发出灰霉病的病样中分离到与原分离物形态特征一致的灰葡萄孢霉。根据柯赫氏法则, 石斛灰霉病的病原为灰葡萄孢霉。据报道, 该病原的寄主范围极为广泛, 几乎可以寄生所有的双子叶植物^{[8, 9]}, 但在铁皮石斛上尚未见明确的报道。

石斛需要温暖潮湿、散射光等生长条件, 而这些条件也是多数病害发生的适宜条件, 在自然状态下, 由于植株密度小, 灰霉病发生相对较少、较轻; 但在人工栽培条件下, 灰霉病则多发、重发。人工栽培石斛灰霉病多发、重发的原因可能有以下3个方面:1)人工栽培石斛密度远高于自然状态; 2)人工栽培相对密闭的环境及增湿等栽培措施有利于形成灰霉病发生所需的高湿和结露的条件; 3)人工栽培所采用的增肥等促进石斛快速生长的栽培措施很可能降低植株对灰霉病的抗病性。