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吴新义, 吴晓花, 徐沛, 汪宝根, 鲁忠富, 余晓虹, 李国景. 瓠瓜浙蒲8号DNA指纹图谱构建及纯度检测[J]. 浙江农业科学, 2017,(7):1150-1152 152  
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瓠瓜浙蒲8号DNA指纹图谱构建及纯度检测
吴新义, 吴晓花, 徐沛, 汪宝根, 鲁忠富, 余晓虹, 李国景*
浙江省农业科学院蔬菜研究所 省部共建农产品质量安全国家重点实验室培育基地,浙江 杭州 310021
通讯作者：李国景(1966—),男,浙江东阳人,研究员,博士,从事蔬菜育种与栽培技术研究工作,E-mail:ligj@mail.zaas.ac.cn。

作者简介:吴新义(1984—),男,河南南阳人,助理研究员,博士,从事蔬菜分子育种工作,E-mail:wuxinyi@mail.zaas.ac.cn。

基金项目: 浙江省重大科技专项(2016C02051); 浙江省公益性行业(农业)科研专项(201403032); 浙江省农业科学院青年人才培养项目(2016R23R08E04)
摘要

浙蒲8号是浙江省农业科学院蔬菜研究所最新育成的F1代耐热瓠瓜新品种。为品种权保护及杂交种纯度鉴定提供科学依据,该研究从162对瓠瓜InDel标记中筛选出8对诊断性标记,在此基础上构建了浙蒲8号的DNA指纹图谱;利用其中1对标记BID046,使用KAPA3G Plant PCR试剂盒建立了快速、准确鉴定种子纯度的技术,该技术实现了一步法进行DNA提取和PCR扩增,大大提高了鉴定效率,为浙蒲8号建立了指纹图谱和种子纯度快速鉴定技术,可以为其他瓠瓜品种鉴定所借鉴,促进了瓠瓜种子产业的健康发展。

关键词: 瓠瓜; 指纹图谱; 种子纯度; InDel标记
中图分类号:S642.9 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2017)07-1150-03 doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20170717

瓠瓜[Lagenaria siceraria (Molina) Standl.]又名瓠子、长瓜、蒲瓜、夜开花、葫芦等, 是中国南方地区夏季主要的瓜类蔬菜作物, 目前全国栽培总面积超过20万hm2。浙江省为瓠瓜主栽地区之一, 仅设施栽培面积就超过0.67万hm2。目前, 市场上的商品种子主要有杂交种和常规自交种, 品种繁多, 纯度不一, 同种异名现象严重, 种子质量纠纷时有发生。建立能快速准确地鉴定品种和进行纯度分析的技术对于种子质量标准化、品种审定、假种辨别、产权纠纷均有重要作用。

传统的种子鉴别方法一般有田间种植鉴定、室内生化鉴定等方法[1, 2]。田间种植需要一定的种植面积, 受环境影响较大, 试验周期长且难以获得准确的测试结果; 室内生化鉴定包括组织化学鉴定、同工酶检测、籽粒醇溶蛋白检测等方法, 虽比田间鉴定准确, 但大部分方法只能用于检测部分作物的个别品种, 且常因材料间遗传背景相似或操作技术复杂降低了检测的灵敏度。随着分子标记技术的飞速发展, 越来越多的作物已经使用分子标记鉴别种子纯度和真伪, 并根据不同标记的多态性建立可以识别品种身份的DNA指纹图谱[3, 4, 5]。分子标记源于DNA水平的差异, 在植株幼苗阶段即可进行检测, 且不受基因表达和环境条件的影响, 技术简单、快速, 结果准确可靠, 目前已经广泛用于作物种子鉴定[6, 7, 8]。

浙蒲8号为浙江省农业科学院蔬菜研究所最新育成的耐热瓠瓜新品种[9], 于2015年2月通过浙江省非主要农作物品种审定委员会审定, 目前已在浙江、山东、湖北、福建和安徽等地进行示范, 累计推广约100 hm2, 为了保护浙蒲8号的品种权, 为杂交种纯度鉴定提供科学依据, 本研究使用InDels标记构建了浙蒲8号的DNA指纹图谱, 并建立了快速鉴别种子纯度的技术体系。

1 材料与方法
1.1 材料

浙蒲8号杂交种(F1)及其父本(P1)和母本(P2)。所有材料播于穴盘中, 置于光照培养箱内, 控制温度为白天30 ℃, 夜晚25 ℃, 光照时间为白天14 h, 夜晚10 h。

1.2 InDel标记信息

本课题组前期对2个瓠瓜品种杭州长瓜和J129进行了简化基因组测序, 利用这2个品种的序列开发了892对InDels标记, 本研究使用其中插入-缺失长度超过2 bp的162对标记[10]。

1.3 DNA指纹图谱构建

取生长2周的浙蒲8号幼嫩叶片, 液氮研磨后利用DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取基因组DNA。PCR反应体积为12.5 μ L, 包含2 μ L 模板DNA(10~20 ng· μ L-1), 1.25 μ L 10× PCR buffer(成分为15 mmol· L-1 MgCl2, 100 mmol· L-1 Tris-HCl, pH 8.3, 500 mmol· L-1 KCl), 1 μ L dNTP(2.5 mmol· L-1), 上下游引物各0.3 μ L, 0.01 μ L Taq聚合酶(5 U· μ L-1), 7.64 μ L ddH2O。PCR反应程序:94 ℃ 3 min; 94 ℃30 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s, 35个循环; 72 ℃ 5 min, 4 ℃保存。取3 μ L PCR产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(AcrBis为19:1或39:1), 指示剂为二甲苯青, 电泳电压为200 V, 电泳时间1 h, 用银染法染色显带[11], 照相后用Photoshop软件对图片进行处理, 观察。

1.4 种子纯度鉴定

待浙蒲8号单株生长至1叶1心期, 用打孔器取直径约0.3~0.5 cm的叶片, 加入KAPA3G Plant PCR试剂(KAPABIOSYSTEMS, KK7251)和引物, 直接放入PCR仪进行扩增。PCR反应体系为50 μ L:25 μ L 2× KAPA Plant PCR Buffer, 10 μ L MgCl2(25 mmol· L-1), 上下游引物各1 μ L, 0.4 μ L KAPA3G植物DNA聚合酶(2.5 U· μ L-1), 加入ddH2O使终体积为50 μ L。PCR反应程序:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s, 35个循环; 72 ℃ 5 min, 4 ℃保存。采用普通的PAGE凝胶电泳对PCR产物进行分离和观察。

2 结果与分析
2.1 浙蒲8号DNA指纹图谱构建

根据162对标记在浙蒲8号和其他8份材料中的扩增情况, 从扩增条带的稳定性、引物多态性和多态性条带的易分辨程度综合考虑, 从中选择了BID039、BID046、BID052、BID089、BID096、BID105、BID122、BID137共8对标记, 作为浙蒲8号的诊断性标记(表1)。这8对标记均为共显性标记, 据此构建了浙蒲8号基于InDel标记的DNA指纹图谱(图1)。

表1 8对诊断性InDel标记的引物序列信息

图1 浙蒲8号的标准DNA指纹图谱1~8依次为BID039、BID046、BID052、BID089、BID096、BID105、BID122和BID137

2.2 浙蒲8号种子纯度检测

根据浙蒲8号的指纹图谱, 从中选择1个标记BID046来检测种子的纯度。从图2可以看出, BID046在浙蒲8号、亲本P1和P2中扩增出3种带型, 其中亲本P1的带型较高, 亲本P2的带型较低, 而浙蒲8号为2条带型。在检测的62株中, 发现1株为假杂种, 种子纯度为98.4%。假杂种单株的带型为母本P1的带型, 推测可能是自花授粉造成。

图2 浙蒲8号的纯度检测情况a中1、2为标准浙蒲8号, 3、4为其母本和父本; b为浙蒲8号的代表性单株, 第4株为假杂种

3 讨论

基于全基因组重测序的InDel标记, 因其具有在基因组内分布广、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易等优点, 受到越来越多的关注。与传统的SSR标记相比, InDel标记扩增出的带型简单, 特异性更强, 在遗传分析和基因诊断中准确性和分辨率更高。目前, InDel标记已经应用于黄瓜、水稻等作物种子鉴定[12, 13]。本研究从162对InDel标记中筛选出8对标记构建了浙蒲8号的指纹图谱, 为该品种未来的生产推广提供了特殊、唯一的身份证明, 有助于品种权保护和打击种子伪冒现象。

在传统的分子标记鉴定种子纯度过程中, DNA提取耗时费力, 是限制大规模鉴定的主要因素。本研究使用KAPA3G Plant PCR试剂盒, 实现了一步法进行DNA提取和PCR扩增, 大大提高了工作效率。本研究建立了快速鉴定浙蒲8号种子纯度的技术体系, 该体系有以下几个优点:1)耗时短, 从播种到获得鉴定结果, 最快只需5 d, 其中植株生长4 d, 鉴定1天; 2)效率高, 无论是子叶还是真叶, PCR扩增效果基本没有差别, 可以在子叶露出后立即取样, 无需提取基因组DNA, 大大节省了时间和工作量; 3)纯度鉴定取样很少, 其余整株可以用来做其他鉴定, 如CGMMV检测, 实现1次发苗检测多个指标; 4)费用低, 普通的试剂盒每个样品仅DNA提取的费用为6元以上, KAPA3G试剂盒从提DNA到PCR扩增, 每个样本费用也约为6元。本研究建立的瓠瓜种子纯度鉴定技术体系也可以用于其他蔬菜作物的种子鉴定。

The authors have declared that no competing interests exist.

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