作者简介:李关艳(1991—),女,云南昭通人,硕士,研究方向为药用植物种苗繁育, E-mail:1319048359@qq.com。
建立起一套基于液相色谱串联质谱联用法(LC-MS)测定石杉碱甲(Hup A)含量的方法。样品用1.5%CH3COOH提取总生物碱,在正离子模式下,采用离子监测模式(SIM)检测,定量分析离子为50~2 000 m/z,在Agilent ZORBAX SB-C18平台上(4.6 mm×250 mm),流动相(体积比)为甲醇:水(90:10),流速0.5 μL·min-1,检测波长310 nm,柱温28 ℃,进样量10 μL。结果表明,在前述试验条件下,Hup A在50~400 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好( r=0.999 4)。利用该方法测定4产地蛇足石杉不同部位Hup A含量,结果显示,蛇足石杉叶和茎中的含量均是云南(玻璃温室种植)>江西>湖南>福建。
蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev], 又名蛇足石松、千层塔、金不换, 具有止血散瘀、消肿止痛、清热除湿、解毒等功效, 民间主要用于治疗跌打损伤、瘀血肿痛、内伤出血、毒虫叮咬、烧伤烫伤等症[1, 2]。自1972年中国首次报道该植物中所含的生物碱— — 石杉碱甲(Hup A)在动物试验中有松弛横纹肌的作用后, 研究人员后续又发现Hup A是一种高效、低毒、可逆、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂, 可用于改善记忆力, 治疗重症肌无力和老年性痴呆等疾病, 并对抑制有机磷酸中毒有一定功效, 其制剂哈伯因已在国内上市, 主要用于治疗老年人记忆减退和早年痴呆等[3, 4, 5]。
国内外研究学者对Hup A衍生物、类似物的合成及全合成做了众多研究, 但其合成步骤烦琐、成本较高, 且存在环境污染及难以获得纯光学活性合成物等问题, 至今仍无法进行工业化生产[6, 7, 8]。也有学者基于内生真菌与其共生宿主可以交换遗传物质这一理论, 从野生蛇足石杉中分离纯化内生真菌获得产石杉碱甲菌株, 虽然从已分离获得的内生真菌代谢产物中能够提取出与宿主植物相同的活性成分Hup A, 但野生菌发酵次生代谢产物中所含石杉碱甲量甚微, 离工业化生产石杉碱甲还有很大距离[9, 10, 11, 12, 13]。因此, Hup A的市场供给主要还是以自然资源为主, 少量人工栽培。蛇足石杉在自然界中生长极其缓慢, 其孢子约需15 a才能自然萌发[14], 而且由于其生长环境因子不同, 不同生长地点的蛇足石杉中Hup A含量亦不同, 导致不同产地原材料质量参差不齐。本研究拟建立起一套基于HPLC-MS直接测定蛇足石杉中Hup A含量的方法, 并利用该方法对比了不同生长地蛇足石杉不同部位中Hup A的含量, 以期为蛇足石杉植物资源的采摘、栽培以及蛇足石杉质量控制和评估提供新的参考依据。
Agilent 1100 LC/MS Series Trap SL系统, 美国Agilent公司; 色谱柱, ZORBAX SB-C18(5 μ m, 4.6 mm× 250 mm); 电子天平, 梅特勒-托利多仪器上海有限公司; HHS数显恒温水浴锅, 郑州长城科工贸有限公司; 超声波清洗机, 昆山超声仪器有限公司; 微型植物试样粉碎机, 北京中兴伟业仪器有限公司; 旋蒸仪, EYELA倍捷科技; 循环水式真空泵, 巩义市予华仪器有限公司。
蛇足石杉对照品购买于国家标准品对照品供应站, Hup A对照品经HPLC峰面积归一化法检测质量分数大于97.0%。本试验所用的云南蛇足石杉成株, 于2014年9月至2016年6月种植在昆明理工大学现代农业工程试验性玻璃温室, 湖南蛇足石杉于2016年6月采购于湖南省保靖县白云山, 福建蛇足石杉于2016年6月采购于福建省南平市政和镇, 江西蛇足石杉于2016年6月采购于江西省宜春市宜丰县。甲醇为进口色谱纯, 水为娃哈哈饮用纯净水, 氨水、氯仿、冰醋酸均为分析纯。
石杉碱甲结构优化采用B3LYP/6-311++G(d, p)方法与基组, 将此结构作为激发态输入文件, 在TDDFT/B3LYP/6-311++G(d, p)方法与基组下计算50个激发态分子轨道跃迁能量, 所得计算值采用函数拟合。计算结果表明, 该分子在297 nm左右有较大的紫外吸收。根据此数据, 设定280、290、300、310 nm波长进行测定分析。结果显示, 在波长310 nm下, 能有效减少样品中其他成分的干扰, 其灵敏度和响应值最大, 因此, 后期检测波长采用310 nm。
Agilent 色谱柱; 流动相为甲醇:水, 体积比90:10, 流速0.5 μ L· min-1; 检测波长310 nm; 柱温28 ℃; 进样量10 μ L。
ESI离子源, 离子阱质量分析器; 干燥气温度350 ℃, 干燥气流量9 L· min-1; 喷雾压力35 psig(英制单位, 仪器设定需要, 1 psi=6.894 76 kPa); 毛细管电压3 500 V。在正离子模式下, 采用选择离子监测模式(SIM)检测, 其定量分析离子为m/z 50~2 000。
精密称重Hup A对照品8 mg, 用甲醇定容至20 mL, 配制成浓度为400 μ g· mL-1的石杉碱甲对照储备液, 再分别稀释成50、100、160、200 μ g· mL-1的对照品溶液, 封口置于4 ℃冰箱, 临用放置至室温。
为不同产地的新鲜蛇足石杉植株编号, 用流动水洗净根部泥土, 洗净的植物样品置于50 ℃烘箱烘干至恒重, 粉碎并精确称重后置于100 mL三角烧瓶中, 加入1.5% CH3COOH, 料液比1:10, 冷浸12 h, 超声45 min(水温45 ℃, 功率80%), 冷却后过滤。浓氨水碱化至pH值9, 氯仿萃取3次, 每次200 mL, 合并氯仿提取液回收至干, 甲醇溶解后定容至5 mL, 取1 mL溶液过0.45 μ m有机滤头, 置于液相瓶中以备分析。
应用SPSS 17.0的ANOVA过程进行单因素方差分析, 多重比较采用Duncan法(P=0.05)。
按1.4、1.5节设定的条件进行测定, 采用外标法进行定量, 对照品及样品的检测谱图分别见图1、图2。可见在试验设定条件下, 各成分分离效果良好, 峰形对称, 无拖尾现象。对照品及样品中Hup A的保留时间分别为9.487、9.793 min, m/z=243为Hup A的[M+H]+峰, 整个分离过程只需11 min。
按1.4、1.5节设定的条件分析5组浓度的对照品溶液(50、100、160、200、400 μ g· mL-1), 以峰面积为纵坐标y, Hup A浓度(μ g· mL-1)为横坐标x进行回归, 得标准曲线y=27.192x+16.283(R2=0.999 4), 在50~400 μ g· mL-1浓度范围内线性关系良好。
取400 μ g· mL-1的Hup A对照品溶液, 按1.4、1.5节设定的条件, 重复进样5次, 测得Hup A峰面积的变异系数(RSD)为0.71%, 表明仪器的精密度良好。
取玻璃温室种植蛇足石杉全株, 按1.7节设定的条件提取, 按1.4、1.5节设定的条件进行测定, 重复5次, Hup A峰面积的RSD为1.75%, 表明该方法重复性良好。
取4产地的蛇足石杉样品, 按1.7节方法制备成溶液后, 分别放置1、3、5、8、12 h, 依照1.4、1.5节设定的条件进行测定。在12 h内, 4个产地样品溶液中Hup A峰面积的RSD(n=3)分别为:玻璃温室0.63%, 湖南0.77%, 福建0.87%, 江西0.62%, 表明供试样品中的Hup A在12 h内稳定。
取400 μ g· mL-1的Hup A对照品溶液0.3 mL加入0.7 mL的样品提取液中, 按1.4、1.5节设定的条件测定, 计算Hup A的含量, 计算加样回收率。结果详见表1。可以看出, 样品的回收率整体较高, 在94.74%~98.06%, 且变异系数在1.67%~1.91%。
按1.4、1.5节设定的条件, 采用外标法进行定量, 4个产地蛇足石杉中Hup A在茎、叶中的含量见图3。可以看出, 不同栽培环境对蛇足石杉药用成分Hup A含量具有显著影响。蛇足石杉叶片中Hup A的含量以种植于温室大棚的样品最高, 且显著(P< 0.05)高于其他样品, 福建样品叶片中Hup A的含量最低, 且显著(P< 0.05)低于其他样品。蛇足石杉茎中Hup A的含量以种植于温室大棚与江西样品最高, 且显著(P< 0.05)高于其他样品, 福建样品茎中Hup A的含量最低, 且显著(P< 0.05)低于其他样品。总体来看, Hup A在蛇足石杉叶和茎中的含量均是云南(玻璃温室种植)> 江西> 湖南> 福建。
不同的化合物各自都对应有最大紫外吸收波长, 只有在最大紫外吸收波长下, 才能获得最大的响应值[15]。Hup A结构优化采用B3LYP/6-311+++G(d, p)方法与基组, 理论测算显示, 该分子在297 nm有较大的紫外吸收, 实测结果310 nm, 与理论值十分接近且误差在15 nm之内, 表明该理论测算方法具有较强的指导意义。
先前的研究多采用HPLC法对蛇足石杉植株的Hup A等生物碱进行分离检测, 本试验首次使用LC-MS法对蛇足石杉植株的Hup A进行检测, 结合离子荷质比可以更准确地确定Hup A的分离情况。相比袁经权等[16]、杜次等[17]的试验结果, 本试验条件下各成分分离效果良好, 峰形对称, 无拖尾现象, 整个分离过程只需11 min, 洗脱时间更少, 且避免了使用毒性较高的乙腈洗脱试剂和酸性溶液, 有助于保护试验人员和分析仪器。
蛇足石杉生长范围广, 环境因子对其Hup A含量影响较大[18], 相比袁经权等[16]报道的Hup A含量(广西龙胜县蛇足石杉, 茎中含量0.018 0%、叶中0.035 9%), 本试验中温室大棚种植的蛇足石杉茎(0.044 4%)叶(0.055 9%)部位中Hup A的含量更高, 与杜次等[17]描述的湘西凤凰两头羊产地蛇足石杉茎叶中Hup A含量(0.043 8%、0.055 2%)相差不多。在生物碱的提取过程中, 浸泡温度、浸泡时间、酸化程度、溶剂选择、提取手段、pH值以及萃取次数等都会对生物碱的提取率造成一定的影响。本试验在传统提取手段中加入超声波协助溶剂提取, 通过控制温度、超声时间等措施, 有助于提高生物碱的提取率。
总体来看, 本试验所采用的基于LC-MS测定蛇足石杉中Hup A含量的方法快速, 简便, 准确, 重复性好, 可为蛇足石杉植物资源的采摘、规模化栽培以及质量控制和评估等提供新的参考依据。
The authors have declared that no competing interests exist.
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