苦蘵总黄酮的提取及含量测定
薛洁, 廖昕玥, 俞春娜, 薛婧萍, 冯尚国, 王慧中, 展晓日*
浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室 杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江 杭州 310036
通讯作者:展晓日,E-mail: xiaorizhan@163.com

作者简介:薛洁(1992—),女,安徽六安人,硕士研究生,研究方向为药用植物化学成分与质量控制,E-mail:1210814349@qq.com

摘要

以提取苦蘵总黄酮含量为评价指标,乙醇体积分数、料液比、提取时间为考察因素,采用正交试验法确定总黄酮的最佳提取工艺。结果表明,最佳工艺为乙醇体积分数30%,料液比1:60,提取时间60 min。芦丁在0.1~0.5 mg·mL-1,线性关系良好( r=0.999 5),平均回收率为98.0%,相对标准偏差1.00%。所确定的提取工艺简单、易于操作、提取率高,可用于苦蘵总黄酮的测定。

关键词: 苦蘵; 总黄酮; 含量测定
中图分类号:S567 文献标志码:B 文章编号:0528-9017(2018)10-1839-03

苦蘵(Physalis angulata L.)是茄科酸浆属一年生草本植物, 是一种民间常用的药用植物, 其根、茎、叶、宿萼、果实均可用药。其化学成分主要为甾体类(酸浆苦味素类和睡茄内酯类)、黄酮类、有机酸类、多糖类等化合物[1], 具有清热, 利尿, 解毒, 消肿之功。现代药理研究发现, 苦蘵具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗炎、抗菌等药理活性[2, 3, 4, 5, 6]。黄酮类化合物作为其主要有效成分之一, 具有保护心血管、抗肝脏毒、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[7]。但目前苦蘵化学成分及质量标准研究多集中于甾体类化合物, 对苦蘵中黄酮类化合物研究相对较少。本研究针对苦蘵中总黄酮的提取及含量测定方法进行了研究, 为更加有效地开发和利用苦蘵提供一定的科学依据。

1 仪器与试药
1.1 仪器

Evolution 201 紫外分光光度计(美国Thermo公司); MS104S电子天平(瑞士梅特勒公司); DHG9203A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司); KQ5200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); 5418R离心机(德国Eppendorf公司)等。

1.2 试剂

芦丁对照品购自中国食品药品检定研究院(批号100080-201409); 乙醇, 亚硝酸钠, 硝酸铝, 氢氧化钠等均为分析纯; 水为蒸馏水。

苦蘵果实采自不同产地, 经杭州师范大学生命与环境科学学院冯尚国老师鉴定为茄科酸浆属苦蘵的果实。将其宿萼剥下, 40 ℃烘干48 h, 粉碎, 过40目(孔径0.42 mm)筛, 备用。

1.3 溶液的制备

1.3.1 供试品

取苦蘵宿萼粉末约0.02 g, 精密称定, 于 2 mL离心管中, 加入1.2 mL体积分数为30%的乙醇水溶液, 超声提取60 min。12 000 r· min-1离心10 min, 取上清液, 备用。

1.3.2 对照品

取芦丁适量, 精密称定, 于容量瓶中, 30%乙醇溶解并定容至刻度, 摇匀, 即得0.1 mg· mL-1的对照品储备溶液。

2 结果与分析
2.1 方法学的考察

2.1.1 线性关系

分别精密吸取对照品储备液溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中, 加入5%亚硝酸钠0.4 mL, 摇匀, 静置6 min, 加10%硝酸铝0.4 mL, 摇匀, 静置6 min, 加1 mol· L-1的氢氧化钠4 mL, 再加30%乙醇定容至刻度, 摇匀, 静置15 min, 以空白对照液调零, 在波长505 nm处测定吸光度, 以吸光度(Y)为纵坐标, 以浓度(X)为横坐标, 进行线性回归, 得芦丁标准曲线。其线性回归方程:Y=1.009 X-0.004, r=0.999 5, 说明0.1~0.5 mg· mL-1, 线性关系良好。

2.1.2 精密度

精密吸取对照品储备液3 mL, 共6份。按2.1.1节方法操作, 测定吸光度。总黄酮含量的相对标准偏差为1.38%, 说明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性

精密吸取对照品储备液3 mL, 按2.1.1节方法操作。分别放置0、15、30、45、60 min, 测定其吸光度。总黄酮含量的相对标准偏差为0.93%, 说明在60 min内稳定性良好。

2.1.4 重复性

取同一批苦蘵宿萼粉末6份, 按1.3.1节样品溶液制备方法进行制备, 按2.1.1节方法操作, 测定吸光度。总黄酮含量的相对标准偏差为0.99%, 说明该方法重复性良好。

2.1.5 加样回收率

取已知含量的同一批苦蘵宿萼粉末0.02 g, 6份, 精密称定, 精密加入对照品储备液1 mL, 按1.3.1节样品溶液制备方法进行制备。按2.1.1节方法操作, 测量吸光值, 计算加样回收率。

总黄酮的平均回收率为98.0%, 相对标准偏差为1.00%, 说明加样回收率符合要求。

2.2 苦蘵总黄酮提取工艺的优化

2.2.1 单因素试验

分别考察乙醇体积分数、提取时间、料液比对苦蘵总黄酮提取的影响。

乙醇体积分数对苦蘵总黄酮提取的影响。按料液比1: 50加入体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇超声提取60 min, 12 000 r· min-1离心10 min, 取上清液, 测定样品总黄酮含量。

由图1可知, 随着乙醇体积分数的不断增加, 总黄酮得率先增加后减少。当乙醇体积分数为40%时, 总黄酮得率最高。

图1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

提取时间对苦蘵总黄酮提取的影响。按料液比1: 50, 加入体积分数为40%的乙醇溶液, 分别超声提取15、30、45、60、75 min, 测定样品总黄酮含量。

由图2可知, 随着提取时间的增加, 总黄酮得率先增加后减少。当提取时间增加到60 min时, 总黄酮得率最高。

图2 提取时间对总黄酮得率的影响

料液比对苦蘵总黄酮提取的影响。分别按1: 20、1: 30、1: 40、1: 50、1: 60、1: 70的料液比(m/V)用体积分数为40%的乙醇超声提取60 min, 测定样品总黄酮含量。

由图3可知, 随着料液比的不断增大, 总黄酮得率逐渐增加。当料液比为1: 50时, 总黄酮得率最高。

图3 料液比对总黄酮得率的影响

2.2.2 正交试验

根据单因素实验结果, 选用L9(34)因素水平表进行正交试验。1~3水平, 乙醇体积分数(A)分别为30%、40%和50%, 提取时间(B)分别为30、45和60 min, 料液比(m/V, C)分别为1: 40、1: 50和1: 60。有关结果见表1

表1 多因素对总黄酮含量的影响

表1分析可知:不同因素对总黄酮提取效果的影响顺序为A> C> B, 即乙醇体积分数> 料液比> 提取时间。苦蘵总黄酮的最佳提取条件为A1B3C3, 即30% 乙醇溶液, 料液比1: 60, 提取60 min。

2.3 不同产地苦蘵中总黄酮的含量

取不同产地苦蘵宿萼粉末, 按2.1.1节方法制备供试品溶液, 按1.3.2节加入5%亚硝酸钠0.4 mL在波长505 nm处测定吸光度, 计算不同产地苦蘵中总黄酮的含量(表2)。

表2 不同产地苦蘵的总黄酮含量
3 小结

结合单因素试验和正交试验, 比较了乙醇体积分数、料液比、提取时间3个因素对苦蘵总黄酮提取率的影响, 确定了苦蘵总黄酮的最佳提取工艺为30%乙醇溶液, 料液比1: 60, 提取60 min。并采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定了苦蘵中总黄酮的含量, 该方法操作简便、快速、准确, 为苦蘵的进一步开发利用提供了一种可行的质量控制方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献:
[1] 方雷, 展晓日, 俞春娜, . 苦蘵化学成分及药理作用研究进展[J]. 杭州师范大学学报(自然科学版), 2016, 15(6): 613-616. [本文引用:1]
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[3] MEDINAMEDRANO J R, ALMARAZABARCA N, GONZÁLEZELIZONDO M S, et al. Phenolic constituents and antioxidant properties of five wild species of Physalis (Solanaceae)[J]. Botanical Studies, 2015, 56(1): 1-13. [本文引用:1]
[4] PINTO L A, MEIRA C S, VILLARREAL C F, et al. Physalin F, a seco-steroid from Physalis angulata L. has immunosuppressive activity in peripheral blood mononuclear cells from patients with HTLV1-associated myelopathy[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2016, 79: 129-134. [本文引用:1]
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[7] 吴立军. 天然药物化学[M]. 北京: 科学技术文献出版社, 2006. [本文引用:1]