Agilent 1260 HPLC-6530 Accurate-Mass Q-TOFLC/MS液质联用仪; 日本岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪。天麻素对照品:中国食品药品检定研究院, 批号为11807-200205; 对羟基苯甲醇:武汉金诺化工有限公司, 批号为SH0530; 甲醇、乙腈为色谱纯, 其余均为分析纯。小白菜种子(南京秋田种业研究所, 检疫证明编号:3201000020100106)由湖南中医药大学谭朝阳教授购于湖南省长沙市望城市场。

1.2.1 营养液配制

采用的营养液配方为华南农业大学叶菜配方。大量元素配方:A液含Ca(NO₃)₂· 4H₂O 472 mg· L^-1、KNO₃ 202 mg· L^-1、NH₄NO₃ 80 mg· L^-1; B液含KH₂PO₄ 100 mg· L^-1、K₂SO₄174 mg· L^-1、MgSO₄· 7H₂O 246 mg· L^-1。将大量元素的各种化合物扩大400倍后用电子天平称量, 并分别用蒸馏水溶解配成A液和B液的母液。微量元素配方(C液):FeSO₄· 7H₂O 27.8 mg· L^-1、EDTA-2Na 37.2 mg· L^-1、H₃BO₃ 2.86 mg· L^-1、MnSO₄· 4H₂O 2.13 mg· L^-1、ZnSO₄· 7H₂O 0.22 mg· L^-1、CuSO₄· 5H₂O 0.08 mg· L^-1、(NH₄)6Mo₇O₂₄· 4H₂O 0.02 mg· L^-1, 将各化合物称量扩大1 000倍, 用电子天平称取后混合在一起溶解并装在棕色储器内。使用时分别取大量元素A母液和B母液各25 mL加入6 L水中, 边加边搅拌直到没有沉淀之后, 加入微量元素母液10 mL并定容至10 L。

1.2.2 处理设计

将正常生长的小白菜按每组12株分为A、B、C、D共4组, A组为对照组, 营养液中不加对羟基苯甲醇, B、C、D组为实验组, 分别在营养液中添加1、2、3 mmol· L^-1对羟基苯甲醇。以上4组小白菜在25 ℃恒温玻璃大棚中培养, 每隔6 d更换一次含相应浓度对羟基苯甲醇的营养液, 同时采收3株小白菜, 记录每株小白菜的株高和根长, 并按以下方法进行天麻素含量测定。首先, 每株小白菜取10 g叶片剪碎, 加入50%甲醇10 mL, 精密称量后加热回流1 h, 用50%甲醇补足加热回流损失的质量, 并用滤纸过滤后取过滤液作为供试品溶液。其次, 精密称量天麻素标准品和对羟基苯甲醇标准品, 分别加入50%甲醇制成每1 mL中含0.05 mg的标准品溶液, 并按1∶ 1混合后用于色谱检测。最后, 用0.45 μ m微孔滤膜过滤供试品溶液和标准品溶液, 进行HPLC检测, 根据两者检测得到的色谱峰面积换算供试品溶液中天麻素的含量。色谱检测条件:Agilent 20RBAX C₁₈柱(4.6 mm× 250 mm, 3.5 μ m particle size), 流速1 mL· min^-1, 流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(体积比3∶ 97), 检测波长为220 nm, 柱温为40 ℃, 进样量为20 μ L。

1.2.3 天麻素的液相色谱质谱联用(LC-MS)检测

为进一步确定转化产物是天麻素, 将1.2.2节制备的供试品溶液进行LC-MS检测。其中色谱检测条件为Agilent ZORBAX Bonus-RP色谱柱(150 mm× 4.6 mm, 3.5 μ m), 流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液(体积比6∶ 94), 检测波长为220 nm, 流速为0.5 mL· min^-1, 进样量为10 μ L, 柱温为40 ℃。质谱检测条件为电喷雾正离子模式, 雾化气温度为325 ℃, 干燥气流速为6 L· min^-1, 喷雾器压力为0.28 MPa, 鞘气温度为350 ℃, 鞘气流速为12 L· min^-1, 毛细管电压为4 000 V, 碎裂电压为110 V, 质谱核质比采集50~1 000。

HPLC检测结果(图1)表明, 在小白菜水培营养液中添加前体物质对羟基苯甲醇后, 叶片甲醇提取物中存在天麻素和对羟基苯甲醇, 说明小白菜可通过根系从营养液中吸收前体物质并将其转运至叶中, 然后利用叶肉细胞中的相关糖基转移酶, 催化对羟基苯甲醇发生葡萄糖基化生成天麻素。另外, 也说明葡萄糖基转移酶广泛分布在植物体内, 当有相应前体物质存在时, 它们能催化这些前体物质发生糖基化生成糖苷, 推测多数植物在自然条件下不能自发产生天麻素, 其中一个重要原因与自身不能合成对羟基苯甲醇有关。

图1

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	图1 小白菜转化对羟基苯甲醇生成天麻素的色谱检测结果

对小白菜HPLC图中与天麻素标准品具有相同保留时间的色谱峰进行质谱检测, 结果(图2)显示, 此峰所含物质可与溶液中H⁺、NH⁴⁺、Na⁺、K⁺形成不同的复合物, 所得一级质谱的核质比(m/z)分别为287.115 9、304.139 2、309.094 4、325.068 1。减去以上结合离子的分子量后, 所得数值与天麻素理论分子量286.277 8 u相同, 表明小白菜转化得到的峰含有天麻素, 并进一步证实小白菜体内含有可以将对羟基苯甲醇转化成天麻素的糖基转移酶。

图2

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	图2 小白菜转化对羟基苯甲醇生成天麻素的质谱鉴定结果

结果(图3)显示, 添加不同浓度对羟基苯甲醇后, 小白菜体内均能合成天麻素, 而且在第6天时小白菜转化生成天麻素的含量最高, 此后随着培养时间的延长, 天麻素在小白菜体内的含量则逐渐降低。另外, 随对羟基苯甲醇浓度的增加, 小白菜在第6天转化生成天麻素的量也逐渐增加。以上研究结果可以说明两个问题, 一是小白菜对前体物质的转化具有一定的浓度依赖性, 即前体物质浓度的增大会导致天麻素转化量也随之增大; 二是小白菜对天麻素的积累受时间长短的影响, 在以后大规模水培小白菜获取天麻素时, 要注意小白菜采收时间, 同时还要进一步寻找其他方法来延缓或阻断天麻素在小白菜体内的消耗。另外, 根据天然状态下小白菜不含天麻素这一基本事实, 推测出现以上天麻素逐渐被消耗的原因, 可能与天麻素作为一种小白菜非必须次生代谢物有关, 因为当天麻素在小白菜体内产生之后, 为了满足自身营养所需, 小白菜会继续代谢天麻素生成其他营养物质, 从而导致天麻素难以在小白菜中长期积累。

图3

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	图3 不同浓度对羟基苯甲醇和培养时间对小白菜积累天麻素的影响

水培植物时, 营养液中物质成分的变化会直接影响植物的生长状况。本实验添加的前体物质对羟基苯甲醇为小白菜生长非必须物质, 通过测量根长和株高来反应对羟基苯甲醇对小白菜生长状况的影响。图4显示加入对羟基苯甲醇后, 小白菜的平均根长在前12 d内逐渐增大, 但12 d后由于老根逐渐死亡而出现平均根长开始变短的现象。根作为植物吸收营养物质一个重要器官, 其生长好坏会直接影响整个植株个体特别是株高的生长状况。在水培前18 d小白菜的平均株高都在增长, 但18 d后其平均株高则停止生长, 这一现象与对照组形成了鲜明对比。综合可知, 对羟基苯甲醇作为营养液添加物质对小白菜生长有害, 这与酚类物质对其他植物生长有负面影响相同^{[18, 19, 20]}, 但小白菜能在较短时间和一定浓度范围内抵抗对羟基苯甲醇的危害, 而且这种抵抗能力与对羟基苯甲醇浓度和施加时间呈负相关, 可为进一步探讨合适浓度的对羟基苯甲醇用于大量积累天麻素提供依据。

图4

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	图4 不同浓度对羟基苯甲醇和培养时间对小白菜生长的影响