鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的表达及ELISA诊断试剂盒的研制与应用
亓丽红, 黄兵, 吴家强, 宋玲玲, 王友令, 马秀丽, 于可响, 刘涛, 艾武*, 徐怀英
山东省农业科学院 家禽研究所,山东 济南 250023
通讯作者:艾 武,女,研究员,主要从事禽病防治研究工作, E-mail:aw5970@163.com

作者简介:亓丽红,女,副研究员,从事禽病防治及饲养管理研究工作,E-mail:924893184@qq.com

摘要

为了建立一种鸡传染性支气管炎抗体检测的ELISA方法,本研究根据GenBank中的传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株LC2 N基因序列,设计一对引物,扩增 N基因,将目的基因与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-N,转化 E. coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-N,纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原建立鸡传染性支气管炎抗体检测的间接ELISA方法,并利用所建立的ELISA方法对临床血清样本进行检测。结果表明,IBV N基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达。Western-blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸡传染性支气管炎阳性血清发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为2 μg·孔-1,血清最佳稀释度为1:200,临界值为 D450值≥0.297,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与进口IDEXX试剂盒的符合率为96.25%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸡传染性支气管炎母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。综上所述,本研究所建立的N-ELISA方法是一种有效的鸡传染性支气管炎病血清学诊断的方法,并为进一步研究IBV N蛋白的免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。

关键词: 鸡传染性支气管炎病毒; N基因; 表达; ELISA; 抗体; 检测
中图分类号:S858.31 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2018)05-0866-05

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡急性高度接触性传染病, 以呼吸道症状、蛋种鸡产蛋量下降、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠炎变化为主要特征, 是目前危害国际养禽业的主要疾病之一。由于IBV血清型多, 且新的血清型不断涌现, 而各型间交叉保护率低, 新的变异株不断出现, 组织嗜性也多变, 给诊断和防治带来一定困难[1, 2, 3, 4, 5]

IBV含有3种结构蛋白, 即纤突蛋白S、膜蛋白M和核衣壳蛋白N。N蛋白占病毒总蛋白量的40%, 主要作用是包裹核酸, 与病毒的复制有关[6]。N蛋白还能免疫识别相关靶位, 在细胞免疫和体液免疫中起作用。在进化过程中N蛋白比S1蛋白相对保守, 因此我们通过对N蛋白进行表达, 以此作为群特异性诊断抗原, 建立了检测不同IBV抗体水平的间接ELISA诊断试剂盒。自建试剂盒选择原核表达载体pET-32 a(+)构建重组表达质粒进行融合表达并纯化, 解决了IBV全病毒纯化困难的问题。检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒, 成本低廉、操作简便、快速, 尤其适合批量样品的检测, 大大提高了鸡传染性支气管炎血清学诊断的效率[7, 8, 9, 10]

1 材料与方法
1.1 病毒、试剂及药品

IBV-LC2、表达载体pET32 a、大肠杆菌BL21均为山东省农业科学院家禽研究所禽病诊断与免疫重点实验室保存。限制性内切酶SalⅠ 、EcoRⅤ 及Trizol RNA提取试剂购自TaKaRa公司; 反转录酶(AMV)、RNA酶抑制剂及dNTP混合物购自Promage公司; 酶标HRP-羊抗鸡IgG(工作浓度为1:3 000)购自SouthernBiotech公司; rTaq DNA聚合酶、DNA分子量标准(Marker)购自宝生物工程(大连)有限公司; IBV ELISA检测试剂盒购自IDEXX公司, 其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 IBV N蛋白的扩增及重组表达载体的构建

参照GenBank已公布的IBV-LC2N基因(DQ377139)序列, 设计一对特异性引物, 正链引物为5'-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3'(EcoRⅤ 位点), 负链引物为5'-CCGTCGACACTC AAAGTTCATTCTCTCC-3'(SalⅠ 位点), 扩增片段大小为1 230 bp。引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。提取核酸, 进行RT-PCR。PCR循环参数为:94 ℃变性2 min后, 经94 ℃ 1 min, 50 ℃ 60 s, 72 ℃ 2 min, 共30个循环, 最后于72 ℃延伸10 min。将载体pET32 a和PCR产物进行EcoR V、SalⅠ 双酶切并回收。用T4 DNA连接酶将二者进行16 ℃过夜连接, 转化表达宿主菌感受态细菌BL21, 37 ℃温箱培养16~20 h。挑取单菌落扩大培养, 提取质粒, 用EcoR V、SalⅠ 进行双酶鉴定。将阳性重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。

1.3 重组表达质粒在宿主菌中的诱导表达

将鉴定为阳性的重组菌接种于4 mL LB(含100 μ g· mL-1 Amp)试验培养基中, 待37 ℃振荡过夜, 取出1 mL, 离心, 去上清, 菌体接种于100 mL含Amp的 LB(100 μ g· mL-1)培养基中。37 ℃ 200 r· min-1振荡培养至D600=0.6, 加IPTG至终浓度为1.0 mmol· L-1, 继续诱导培养至4 h, 10 000 r· min-1离心5 min, 收集菌体, 加适量裂解缓冲液, 于冰浴中超声破碎, 10 000 r· min-1离心5 min, 收集上清。加入等体积SDS-PAGE上样缓冲液, 煮沸3~5 min。每孔上样15 μ L, 进行SDS-PAGE电泳。用染色液 R-250染色, 后放入脱色液中脱色。

1.4 表达产物的Western-blot检测

将表达产物进行SDS-PAGE电泳, 待电泳分离后, 切出含待转膜蛋白的凝胶转至硝酸纤维素膜。用含10%小牛血清的PBST洗液浸泡硝酸纤维膜, 37 ℃封闭2 h。用洗液1:100倍稀释鸡抗IBV阳性血清, 将硝酸纤维素膜浸泡其中, 反应1 h, 洗液洗膜3次, 每次5 min。加入新配置的DAB显色液, 避光反应15 min。显色完成后, 将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中终止显色。

1.5 表达的融合蛋白的纯化

按照His-Bind蛋白纯化柱使用说明进行表达蛋白的纯化。将破碎好的重组菌进行SDS-PAGE电泳, 电泳结束后取下凝胶, 先用双蒸水洗涤, 然后浸入4 ℃预冷的250 mmol· L-1的KCl溶液中显色5~10 min, 最后用双蒸水洗涤。将目的蛋白条带切下, 放入2 mL的Eppendorf管中, 加少量的PBS洗涤数次, 加少量的PBS, 用玻璃棒将其捣细, 反复冻融数次, 8 000 r· min-1离心10 min, 吸取上清, SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定, 核酸蛋白分析仪测定蛋白浓度。经SDS-PAGE验证后将纯化后的蛋白分装放入-20 ℃保存备用。

1.6 间接ELISA最佳工作浓度及临界值的确定

用包被缓冲液将IBV N重组蛋白进行倍比稀释, 包被ELISA反应板, 每孔80、40、20、10、5、2.5 μ g· mL-1包被ELISA反应板, IBV阳性血清和阴性血清经大肠杆菌裂解液处理后分别作1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800系列稀释; 进行间接ELISA测定。TMB底物显色, 硫酸终止反应; 测定光波长450 nm的D值。在最佳工作条件下, 对收集的20份无IBV抗体鸡血清进行间接ELISA测定, 确定阴阳性临界值。

1.7 间接ELISA的特异性、重复性试验和抗原保存期试验

用IBV-N蛋白建立的间接ELISA方法分别检测NDV、AIV、EDS-76、IBDV、ILTV等阳性血清及IBV阴性血清进行交叉反应性测定, 每样本2个重复。用2次包被的酶标板, 检测10份IBV阳性血清和10份阴性血清, 每个样品重复检测5次, 测定其变异系数。纯化的重组N蛋白以最佳工作浓度包被封闭后, 待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中4 ℃保存, 后隔12个月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测。

1.8 与IDEXX公司的ELISA试剂盒检测的对比

临床应用检验的样品80份。应用自制ELISA试剂盒和进口IDEXX试剂盒同时检测送检样品, 比较试剂盒的符合率。

1.9 间接ELISA方法的初步应用

将免疫雏鸡所孵出的12日龄的雏鸡分别在免疫前、免疫H120后5、9、21和28 d采血, 分离血清, 间接ELISA测定, 分析母源抗体的消长情况。

2 结果与分析
2.1 载体的构建

阳性重组表达质粒经EcoR V、SalⅠ 双酶切产生5.9 kb的载体条带和约1.23 kb的外源基因片段。并将阳性重组表达质粒命名为PET32 a-LC2-N。结果见图1。测序结果显示插入方向正确, 插入片断为 1 230个核苷酸, 编码410个氨基酸。推测IBV-LC2-N蛋白分子量为45.1 ku, 融合伴侣分子量为20.4 ku, 整个表达融合蛋白为65.5 ku。

图1 pET32 a-LC2-N重组质粒酶切鉴定的结果1为EcoR V、SalⅠ 双酶切质粒pET-LC2-N; 2为DNA分子质量标准; 3为EcoR V、SalⅠ 双酶切质粒pET-LC2-N; 4为DNA分子质量标准

2.2 表达产物的SDS-PAGE与Western-blotting分析

将含有阳性重组载体的大肠杆菌在IPTG诱导下表达, 产物经 SDS-PAGE检测, 在大约65 ku处可见表达条带, 与预期蛋白大小相一致, 而空载体菌诱导后, 没有出现此蛋白条带(图2)。将目的蛋白进行纯化(图3)。Western-blotting分析发现该融合蛋白能与鸡抗IBV阳性血清进行反应, 具有良好的免疫原性, 确定了65.5 ku的蛋白为重组的N蛋白(图4)。

图2 重组蛋白的诱导表达1为pET-32 a诱导表达4 h; 2~6为pET-32 a-IBV-N-BL21诱导表达4 h; 7 为蛋白质分子质量标准

图3 重组蛋白的纯化1为纯化的重组蛋白; 2为蛋白质分子质量标准; 3~6为纯化的重组蛋白

图4 重组蛋白的Western-blot 检测1为重组蛋白; 2为蛋白质分子质量标准; 3为pET-32(+)空载体

2.3 间接ELISA最佳工作浓度及临界值的确定

间接ELISA方阵实验结果(表1)取阳性血清D450 在1.0左右, 阴性血清D450在 0.297左右, 且阳性血清D450/阴性血清D450即P/N值大于2.1的抗原浓度和血清稀释度为最佳工作浓度, 结果如表1所示。从表1~2可以看出, 抗原最佳浓度为20 μ g· mL-1, 血清最佳稀释浓度为1:200。

表1 不同抗原包被量和血清稀释度对D450值的影响
2.4 间接ELISA的特异性、重复性试验和抗原保存期的确定

用IBV-N蛋白建立的间接ELISA方法分别检测NDV、AIV、EDS-76、IBDV、ILTV等阳性血清及IBV阴性血清进行交叉反应性测定, 结果均为阴性, 表明该方法与上述病毒无交叉反应。用2次包被的酶标板, 检测10份IBV阳性血清和10份阴性血清, 每个样品重复检测5次, 测定其变异系数结果表明, 变异系数最大为4.80%, 最小为0.8%。20份血清变异系数都较小, 具有较好的重复性。隔12个月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测。结果显示, 包被本发明的重组N蛋白保存12个月仍可用于检测。

表2 不同抗原包被量和血清稀释度对P/N值的影响
2.5 自制ELISA试剂盒与中和进口IDEXX试剂盒的对比

临床应用检验的样品80份。应用自制ELISA试剂盒和进口IDEXX试剂盒同时检测送检样品, 比较试剂盒的符合率。其中自制ELISA试剂盒检出阳性血清为50份, 阳性检出率为62.5%, 进口IDEXX试剂盒检出阳性血清47份, 阳性检出率为58.75%, 2种方法的符合率为96.25%(表3)。

表3 血清样品的检测结果与IDEXX公司的ELISA试剂盒比较
2.6 间接ELISA方法的应用

用该试剂盒对雏鸡免疫 IBV H120前及免疫后5、9、21及28 d鸡的抗体滴度进行检测, 免疫7 d后开始出现免疫抗体, 然后抗体水平不断升高, 到21 d抗体水平达到最高峰, 随后抗体水平逐渐下降, 28 d时抗体检测为阳性, 抗体持续到28日龄(图5)。

图5 SPF雏鸡免疫后抗体的消长规律

3 小结与讨论

IBV核衣壳蛋白又称核蛋白(N蛋白), 具有很好的抗原性和免疫原性, 在细胞免疫和体液免疫中起着重要作用。体外表达的N蛋白能引起免疫应答, 能使免疫鸡增速产生抗IBV抗体, 可诱导鸡对IBV气管感染的免疫保护作用。用N蛋白免疫鸡后, 可激活T辅助细胞, 同时可增强B淋巴细胞产生抗体的能力。加上N蛋白具有高保守性, 这使得N蛋白及其抗体在IBV诊断方面显示出优势。核蛋白占病毒总蛋白量大, 而且核蛋白为非糖基化蛋白, 由于它能检测群抗体应答, 可以作为IBV群特异性诊断抗原。本研究在利用RT-PCR成功获得了IBV N基因的基础上, 利用原核表达载体pET-32 a成功地表达了N蛋白, 并证实了其具有良好的反应原性。以此重组N蛋白建立了N-ELISA, 经特异性、重复性试验证实了建立的N-ELISA具有良好的应用价值。

通过自制试剂盒来检测免疫H120的IBV抗体消长变化, 可知, 在免疫7 d后, 机体开始产生抗体, 然后抗体水平不断升高, 到21 d抗体水平达到最高峰, 随后抗体水平逐渐下降, 抗体持续到28 d, 符合IBV弱毒疫苗抗体的消长规律, 说明该试剂盒的检测结果可以适用于IBV免疫后的抗体水平检测。自制试剂盒的包被抗原区别于IDEXX的包被抗原IBV。自建试剂盒检测血清时做200稀释。IDEXX试剂盒检测样品时, 血清样品是做500倍稀释, 用这2种方法对80份血清样本进行检测, 比较它们的检测结果发现, 自建试剂盒检测D值普遍都比IDEXX试剂盒的D值高。出现这样的差异可能是由于血清稀释度不同造成的, 也可能与2种试剂盒的包被抗原不同有关。通过比较实验结果表明自制试盒质量可靠, 结果确实, 是一种敏感、快速的临床检测方法。但自制试剂盒其成本低, 可以用于大批量检测, 是我们急需研制的国产同类试剂盒, 以提高我国对IBV的检测水平[8, 11]

(责任编辑:卢福庄)

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献:
[1] 刘程. 鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR和RT-LAMP检测方法的建立 [D]. 成都: 四川农业大学, 2012: 9-23. [本文引用:1]
[2] BANDE F, ARSHAD S S, OMAR A R, et al. Global distributions and strain diversity of avian infectious bronchitis virus: a review[J]. Animal Health Research Reviews, 2017, 18(1): 70-83. [本文引用:1]
[3] SEGER W, GHALYANCHI LANGEROUDI A, KARIMI V, et al. Prevalence of avian infectious bronchitis virus in broiler chicken farms in south of Iraq, 2014—2015[J]. Veterinary Research Forum, 2016, 7(4): 317-321. [本文引用:1]
[4] ZANATY A, ARAFA A S, HAGAG N, et al. Genotyping and pathotyping of diversified strains of infectiousbronchitis viruses circulating in Egypt[J]. World Journal of Virology, 2016, 5(3): 125-134. [本文引用:1]
[5] HEMIDA M G, AL-HAMMADI M A, DALEB A H S, et al. Molecular characterization and phylogenetic analyses of virulent infectious bronchitis viruses isolated from chickens in Eastern Saudi Arabia[J]. Virusdisease, 2017, 28(2): 189-199. [本文引用:1]
[6] 李敏, 李俐睿, 岳建国, . 鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白克隆表达与免疫原性检测[J]. 四川畜牧兽医, 2017, 44(4): 24-27. [本文引用:1]
[7] MODIRI HAMADAN A, GHALYANCHILANGEROUDI A, HASHEMZADEH M, et al. Genotyping of Avian infectious bronchitis viruses in Iran (2015—2017) reveals domination of IS-1494 like virus[J]. Virus Research, 2017, 240: 101-106. [本文引用:1]
[8] 王俞丹, 杨保收, 陈冰, . 鸡IBV鉴别诊断ELISA方法的研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2016(3): 116-117. [本文引用:2]
[9] SULTANKULOVA K T, KOZHABERGENOV N S, STROCHKOV V M, et al. New oligonucleotide microarray for rapid diagnosis of avian viral diseases[J]. Virology Journal, 2017, 14(1): 69. [本文引用:1]
[10] BATRA A, MAIER H J, FIFE M S. Selection of reference genes for gene expression analysis by real-time qPCR in avian cells infected with infectious bronchitis virus[J]. Avian Pathology, 2017, 46(2): 173-180. doi: DOI:10.1080/03079457.2016.1235258.Epub2016Dec7. [本文引用:1]
[11] TSAI C T, TSAI H F, WANG C H. Detection of infectious bronchitis virus strains similar to Japan in Taiwan[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2016, 78(5): 867-871. [本文引用:1]