供试菌株刀孢蜡蚧菌ZJLP09为本实验室从浙江台州地区橘园内的柑橘木虱虫体上分离, 接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基(PDA, 配方为:马铃薯200 g, 葡萄糖20 g, 琼脂20 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然pH值)上, 于4 ℃冰箱保存。

制备PDA培养基平板, 在超净工作台中以无菌接种针挑取斜面上保存的刀孢蜡蚧菌ZJLP09菌块, 接种至PDA平板上, 之后置于微生物培养箱中28 ℃恒温培养7 d。以无菌打孔器在菌落四周打取菌饼, 接种至马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中, 在28 ℃恒温摇床下以转速180 r· min^-1震荡培养3 d。

取上述培养的刀孢蜡蚧菌ZJLP09的分生孢子悬浮液, 按1%的比例接种到各供试培养基中(表1), 置于28 ℃恒温摇床下以转速180 r· min^-1震荡培养, 培养不同时间后取样, 用血球计数板统计孢子数量, 计算各培养基中菌株ZJLP09的产孢量。

表1

表1

表1 液体摇床培养基及配方 编号 培养基名称 培养基配方 A 马铃薯葡萄糖培养基(PDB) 马铃薯200 g, 葡萄糖20 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然pH值 B 马铃薯葡萄糖蛋白胨培养基(PPDB) 马铃薯200 g, 葡萄糖20 g, 蛋白胨10 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然pH值 C 马铃薯蔗糖培养基(PSB) 马铃薯200 g, 蔗糖20 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然pH值 D 沙氏葡萄糖酵母培养基(SDY) 酵母浸出粉10 g, 葡萄糖40 g, 蛋白胨10 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值6.0 E 察氏培养基(CDB) 硝酸钠3 g, 磷酸氢二钾1 g, 硫酸镁0.5 g, 氯化钾0.5 g, 硫酸亚铁0.01 g, 蔗糖30 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值7.3 F 麦芽浸膏培养基(MEB) 麦芽浸膏30 g, 大豆蛋白胨3 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值5.6 G 沙氏葡萄糖培养基(SDB) 酪蛋白胰酶消化物、动物组织的胃酶消化物10 g, 葡萄糖40 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值5.6 H 麸皮培养液 麸皮25 g, 磷酸二氢钾1 g, 磷酸氢二钾1.5 g, 硫酸镁2 g, 硫酸亚铁0.01 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然值pH I 玉米粉麦麸培养液 玉米粉20 g, 麦麸10 g, 蛋白胨5 g, 磷酸二氢钾3 g, 硫酸镁1 g, 硝酸铵1 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然值pH J 麦麸培养液 麸皮100 g, 淀粉 20 g, 蛋白胨5 g, 尿素 2 g, 白糖20 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然值pH K 玉米粉培养液 玉米粉25 g, 磷酸二氢钾1 g, 磷酸氢二钾1.5 g, 硫酸镁0.2%, 硫酸亚铁0.01 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然值pH L 小米浸液培养基 小米10 g, 葡萄糖10 g, 蛋白胨3 g, 碳酸钙2 g, 氯化钠2 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值7.2~7.4 M 黄豆粉浸汁培养基 黄豆粉15 g, 可溶性淀粉20 g, 葡萄糖5 g, 酵母膏2.5 g, 碳酸钙1 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值7.5 N 改良黄豆粉浸汁培养基 黄豆粉20 g, 可溶性淀粉5 g, 蔗糖10 g, 蛋白胨2 g, 酵母膏2 g, 氯化钠2 g, 磷酸氢二钾0.5 g, 硫酸镁0.5 g, 碳酸钙1 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值7.2~7.4 O 大豆粉玉米粉培养基 黄豆粉10 g, 玉米粉10 g, 可溶性淀粉5 g, 磷酸二氢钾 1 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值7.2

表1 液体摇床培养基及配方

取刀孢蜡蚧菌ZJLP09分生孢子悬浮液, 按l%、3%、5%、10%和20%的比例(V/V)分别接入装有培养液的250 mL三角瓶中(接种后共100 mL), 每处理设3个重复。置于28 ℃恒温摇床中以转速180 r· min^-1的条件下连续振荡培养, 培养不同时间后取样, 用血球计数板法计算孢子浓度, 重复测定3次, 取平均值换算成产孢量。

在250 mL三角瓶中分别装入20%、40%、60%、80%的培养液, 121 ℃灭菌20 min后, 在无菌条件下接入分生孢子悬浮液, 接菌量为5%, 每处理设3个重复。置于28 ℃恒温摇床中以转速180 r· min^-1的条件下连续振荡培养, 培养不同时间后取样, 用血球计数板法计算孢子浓度, 重复测定3次, 取平均值换算成产孢量。

在250 mL三角瓶中分别装入40%的培养液, 将pH分别调至4.0、6.0、8.0、10.0, 21 ℃灭菌20 min后, 在无菌条件下接入分生孢子悬浮液, 接菌量为5%, 每处理设3个重复。置于28 ℃恒温摇床中以转速180 r· min^-1的条件下连续振荡培养, 培养不同时间后取样, 用血球计数板法计算孢子浓度, 重复测定3次, 取平均值换算成产孢量。

在250 mL三角瓶中分别装入40%的培养液, 将pH调至6.0, 接菌量为5%, 每处理设3个重复。置于恒温摇床中, 28 ℃下分别以100、150、180、200、220 r· min^-1连续振荡培养, 培养不同时间后取样, 用血球计数板法计算孢子浓度, 重复测定3次, 取平均值换算成产孢量。

在250 mL三角瓶中分别装入40%的培养液, 将pH调至6.0, 接菌量为5%, 每处理设3个重复。置于恒温摇床中, 28 ℃下以180 r· min^-1连续振荡培养6 d。每隔24 h从各三角瓶中取培养液, 用血球计数板法计算孢子浓度, 重复测定3次, 取平均值换算成产孢量。

由表2可知, 菌株ZJLP09在不同液体培养基中产孢量存在明显差异。培养3 d后, 在沙氏葡萄糖酵母培养基(编号D)中的产孢量最高, 含孢量为4.20× 10⁸个· mL^-1; 其次为麦麸培养液(编号J)和马铃薯葡萄糖蛋白胨培养基(编号B), 含孢量分别为3.25× 10⁸个和3.15× 10⁸个· mL^-1; 而察氏培养基(编号E)和玉米粉培养液(编号K)产孢量最低, 分别仅为3.50× 10⁵个和4.00× 10⁵个· mL^-1。随着培养时间的延长, 菌株ZJLP09在多数培养基中的产孢量均明显上升, 其在沙氏葡萄糖酵母培养基(编号D)中的产孢量更增加为1.27× 10⁹个· mL^-1, 为所有供试培养基中最高; 但其在小米浸液培养基(编号L)和大豆粉玉米粉培养基(编号O)中的产孢量表现为下降, 在玉米粉麦麸培养液(编号I)中更难以看到孢子的存在, 多生长为菌丝。据此, 筛选出适于刀孢蜡蚧菌ZJLP09产孢的最佳液体培养基为沙氏葡萄糖酵母培养基。

表2

表2

表2 菌株ZJLP09在不同液体培养基培养不同时间后的产孢量 注:同列数字后不同小写字母表示在P< 0.05水平差异显著。表3~7同。

表2 菌株ZJLP09在不同液体培养基培养不同时间后的产孢量

在不同接种量条件下, 菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表3所示。

表3

表3

表3 在不同接种量条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量 接种量/ % 不同培养时间的产孢量/(个· mL-1) 3 d 7 d 1 4.35× 108 e 1.35× 109 c 3 6.20× 108 d 4.50× 109 a 5 1.50× 109 c 5.35× 109 a 10 3.20× 109 b 3.18× 109 b 20 5.22× 109 a 2.75× 109b

表3 在不同接种量条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量

由表3可知, 接种量越大, 菌株ZJLP09达到产孢高峰的时间越短。其中培养3 d, 20%的接种量条件下菌株产孢量可达5.22× 10⁹个· mL^-1, 而1%接种量条件下菌株产孢量仅为4.35× 10⁸个· mL^-1。随着培养时间的延长, 1%~5%接种量条件下菌株的产孢量明显增加, 其中5%接种量条件下在培养7 d后的产孢量可达5.35× 10⁹个· mL^-1, 而此时10%和20%接种量条件下的产孢量已表现下降趋势。究其原因, 同一液体培养基下, 在通气量等条件一致的情况下, 接种量越大, 孢子浓度越容易先达到最大。在工业化生产中, 为了节约动力消耗, 可以增加接种量; 为了节约接种量, 需增加动力消耗。综合考虑两个因素, 可选用5%的接种量用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

在不同装液量条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表4所示。

表4

表4

表4 不同装液量条件下菌株ZJLP09在 SDY培养基中的产孢量 装液量/% 不同培养时间的产孢/(个· mL-1) 3 d 7 d 20 3.20× 109 a 5.40× 109 a 40 1.85× 109 b 5.50× 109 a 60 1.05× 109 c 5.15× 109 a 80 8.25× 108 d 4.18× 109 b

表4 不同装液量条件下菌株ZJLP09在 SDY培养基中的产孢量

由表4可知, 培养相同时间, 装液量越少, 菌株ZJLP09产孢量越多。在培养3 d和20%装液量条件下, 菌株ZJLP09的产孢量可达3.20× 10⁹个· mL^-1, 而80%装液量条件下, 菌株的产孢量仅为8.25× 10⁸个· mL^-1。说明菌株ZJLP09为好氧型菌株, 增加通气量(即减少装液量)有利于增加菌株产孢。综合考虑材料利用率和产孢总量, 可选用40%的装液量用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

在不同pH条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表5所示。

表5

表5

表5 不同pH条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量 初始pH值 不同培养时间的产孢量/(个· mL-1) 3 d 7 d 3.0 1.20× 108 c 1.05× 109c 4.0 4.65× 108 b 3.85× 109 b 5.0 1.25× 109 a 5.20× 109 a 6.0 1.70× 109 a 5.35× 109 a C 2.10× 107 j 3.70× 107 h D 4.20× 108 a 1.27× 109a E 3.50× 105 o 1.40× 107 k F 1.15× 107 k 2.05× 107 j G 3.05× 108 d 7.40× 108 b H 9.50× 106 l 2.55× 107 i I 8.50× 106 m J 3.25× 108 b 6.70× 108 c K 4.00× 105 n 1.00× 106 m L 2.40× 108 f 1.75× 108 f M 2.70× 108e 4.80× 108 e N 2.00× 108 g 5.90× 108d O 7.65× 107 i 5.50× 106 l

表5 不同pH条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量

由表5可知, 菌株ZJLP09在不同pH的相同培养基中产孢量差异明显, 过酸和过碱都不利于菌株产孢。在pH值5.0~7.0条件下, 菌株ZJLP09的产孢量明显高于其他pH条件下, 在pH值6.0条件下培养3 d, 菌株ZJLP09的产孢量为1.70× 10⁹个· mL^-1, 培养7 d, 其产孢量可达5.35× 10⁹个· mL^-1, 而在pH值3.0和pH值10.0条件下培养3 d的产孢量仅为1.20× 10⁸个和8.85× 10⁷个· mL^-1。因此, 可选用培养基初始pH值6.0用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

在不同转速条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表6所示。

表6

表6

表6 不同转速条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量 摇床转速/ (r· min-1) 不同培养时间的产孢量/(个· mL-1) 3 d 7 d 100 7.20× 108 e 1.35× 109 d 120 9.20× 108 d 3.25× 109 c 150 1.25× 109 c 4.75× 109 b 180 1.85× 109 b 5.40× 109 a 200 2.05× 109 ab 5.45× 109 a 220 2.35× 109 a 5.50× 109 a

表6 不同转速条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量

由表6可知, 转速越快, 菌株ZJLP09达到产孢高峰所需时间越短。在培养3 d及220 r· min^-1转速条件下, 菌株产孢量为2.35× 10⁹个· mL^-1; 而在100 r· min^-1转速条件下, 菌株产孢量仅为7.20× 10⁸个· mL^-1, 在180和200 r· min^-1条件下, 产孢量无显著差异。综合考虑产孢量和能量消耗等因素, 可选用摇床转速为180 r· min^-1用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

不同培养时间后菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表7所示。

表7

表7

表7 不同培养时间菌株ZJLP09在 SDY培养基中的产孢量 培养时间/d 产孢量/(个· mL-1) 2 3.25× 108 d 3 1.75× 109 c 4 3.40× 109 b 5 5.35× 109 a 6 5.50× 109 a 7 5.60× 109 a 8 5.05× 109 a 9 3.20× 109 b 10 2.15× 109 c

表7 不同培养时间菌株ZJLP09在 SDY培养基中的产孢量

由表7可知, 菌株ZJLP09随震荡培养时间的延长, 呈现先增加再饱和后衰减的趋势。其中培养前5 d菌株的产孢量一直呈递增趋势, 至培养第5天产孢量可达5.35× 10⁹个· mL^-1, 与培养第6、7和8天后的产孢量无显著差异, 8 d之后菌株产孢量开始下降。因此, 可选用培养时间为5 d用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。