引用本文
刘玉洋, 徐靖, 何金宇, 刘朋丽, 史钰军, 王慧中, 卢江杰. 铁皮石斛和金钗石斛杂交后代的分子鉴定[J]. 浙江农业科学, 2018,59(9):1709-1713
doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20180960
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铁皮石斛和金钗石斛杂交后代的分子鉴定
刘玉洋1,2, 徐靖3, 何金宇1,2, 刘朋丽1,2, 史钰军4, 王慧中1,2,*, 卢江杰1,2,*
1.杭州师范大学 生命与环境科学学院,浙江 杭州 310036
2.浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室,浙江 杭州 310036
3.浙江省珍稀植物药工程技术研究中心,浙江 武义 321200
4.浙江工商大学 外国语学院,浙江 杭州 310018
通信作者:卢江杰(1982—),男,浙江临安人,讲师,博士,从事药用植物分子生物学研究工作,E-mail: lujj@hznu.edu.cn;王慧中(1962—),男,浙江义乌人,教授,博士,从事中药资源和开发研究工作,E-mail: whz62@163.com。

作者简介:刘玉洋(1991—),男,山东日照人,在读硕士生,研究方向为药用植物分子生物学,E-mail:yuyang19911026@sina.cn。

基金项目: 国家自然科学基金(81503185);浙江省农业(中药材)新品种选育重大科技专项(2016C02058)
摘要

铁皮石斛和金钗石斛是《中华人民共和国药典(2015版)》收录的2种药用石斛,具有重要的药用价值和经济价值。然而,目前关于这2种石斛药用价值的遗传基础研究和优良新品种选育等相对较弱。本研究以铁皮石斛和金钗石斛2个亲本,以及它们的131个F2代杂交单株作为研究对象,从320对SSR引物中筛选出特异性引物,用于铁皮石斛和金钗石斛杂交后代的真假杂种鉴定。结果表明,3对石斛属特异性SSR引物DNtSSR013、DNtSSR147和DNtSSR150,可将杂交群体扩增带型分为真杂交种型、母本型、父本型、缺失型,进而从131个杂交群体F2代中共鉴定出119个真杂交种,真杂交种占杂交群体的91%。因此,利用SSR分子标记技术鉴定石斛杂交群体是可行的,相关结果为铁皮石斛和金钗石斛的遗传图谱构建,石斛多糖和石斛碱等活性成分QTL定位奠定了基础。

关键词: 铁皮石斛; 金钗石斛; 杂交群体; SSR标记; 分子鉴定
中图分类号:S567 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2018)09-1709-05

铁皮石斛和金钗石斛是2种被《中华人民共和国药典(2015版)》收录的兰科石斛属(Dendrobium)植物, 兼具观赏和药用价值[1]。现代医学研究表明, 石斛对咽喉疾病、肠胃疾病、白内障、心血管疾病、糖尿病、肿瘤均具有显著疗效, 特别是对人体肺癌细胞具有高达74.7%~97.2%的抑制率[2, 3]。铁皮石斛是珍稀濒危药用植物保护利用的典范, 经过二十多年的市场培育, 已形成了集科研、种植、加工、销售为一体的铁皮石斛产业。2016年浙江省铁皮石斛产业产值达45亿元, 是全国产销量最大的保健食品之一。金钗石斛是传统中成药石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛清胃散以及现代中成药脉络宁注射液、复方“ 清咽宁” 等的重要配伍成分, 同样具有巨大的市场需求和经济价值[4]。由于市场需求巨大, 一方面过度采挖导致野生石斛资源遭到破坏, 而且石斛品种繁多, 品质参差不齐; 另一方面, 集约化的栽培需要优良的新品种。这就急需广大科研工作者开展石斛新品种选育的相关研究。

杂交后形成的分离群体是亲本遗传图谱构建、优良性状定位和相应性状标记辅助育种的重要材料。杂交后代鉴定的方法主要有形态观察鉴定[5]、细胞学鉴定[6]、同工酶鉴定[7]、分子标记鉴定[8]等, 与传统的鉴定方法相比, 分子标记技术对杂交后代进行鉴定能够快速准确地鉴定出真杂交种, 提高了育种效率。SSR分子标记具有共显性、等位基因数量多、多态性高、重复性好、分析简单等优点[9]。谢文刚等[10]利用SSR分子标记技术对140个鸭茅杂交单株进行鉴定, 利用3对特异引物可快速鉴定出杂交种111份。张自强等[11]对2个马铃薯杂交组合F1群体进行SSR鉴定, 表明SSR分子标记技术用于马铃薯杂交种鉴定是可靠的。张冰清等[12]利用SSR分子标记技术对杂交油菜品种进行鉴定, 发现SSR技术鉴定结果与传统田间鉴定方法结果一致, 证明SSR标记可用于杂交油菜的鉴定。

作为中药材, 石斛种间杂交产生的后代在不清楚其药用价值时, 是不允许被用于生产的。但是在遗传学研究中, 种间杂交由于性状差异明显, 往往比种内杂交可以获得性状分离更加明显的后代, 从而有利于开展遗传图谱构建和优良性状定位。目前, 对石斛的研究大多集中在有效成分、遗传多样性等方面, 其杂交群体的创制、遗传图谱的构建、以及重要性状的QTL定位研究较少。本研究利用SSR分子标记技术对铁皮石斛和金钗石斛的杂交F2代群体进行杂种鉴定, 通过构建有效的种间杂交分离群体, 进而开展铁皮石斛和金钗石斛的遗传图谱构建, 石斛多糖和石斛碱等活性成分的QTL定位。

1 材料与方法
1.1 材料

本试验所用的杂交父本铁皮石斛(♂)为金华寿仙谷药业有限公司育成的仙斛1号(认定编号:浙认药2008003), 杂交母本金钗石斛(♀)为浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室从云南收集的野生种质。从2010年开始进行杂交, 2011年获得杂交F1代, 2014年杂交F1代自交, 2015年获得F2代分离群体。从F2代中随机挑选131个单株作为本试验的研究对象。摘取适量嫩叶片, 放入-70 ℃冰箱中保存, 以用于提取基因组DNA。

1.2 方法

1.2.1 杂交后代基因组DNA提取

用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程公司)提取石斛基因组DNA, 用1%的琼脂糖凝胶检验纯度, 用紫外分光光度计(NanoDrop2000)检测浓度, 并将各DNA样品稀释至20 ng· μ L-1, 4 ℃冰箱保存, 用于后续实验。

1.2.2 SSR引物筛选

浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室开发的320对石斛属SSR引物[13], 由上海生工生物公司合成。以金钗石斛和铁皮石斛基因组DNA作为模板, 对引物进行初步筛选, 条带清晰、重复性好、多态性丰富的SSR引物用于后续实验。

1.2.3 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应体系:总体积10 μ L, 10× Buffer(含Mg2+)1 μ L, dNTPs(10 mmol· L-1)0.3 μ L, 正向引物(10 μ mol· L-1)0.5 μ L, 反向引物(10 μ mol· L-1)0.5 μ L, Taq酶(2 U· L-1)0.5 μ L, DNA模板(20 ng· μ L-1)1 μ L, ddH2O 6.2 μ L(PCR试剂均来自北京鼎国公司)。

聚合酶链式反应程序如下:在Thermal Cycler T100 PCR仪中, 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 各引物退火温度下复性40 s, 72 ℃延伸90 s, 共32个循环; 72 ℃延伸10 min, 最后4 ℃保存。

1.2.4 PAGE胶电泳检测

将矩形玻璃板和凹形玻璃板洗净并擦干后, 用夹子分别夹住玻璃板两端, 水平放置。在烧杯中加入8%丙烯酰胺40 mL, 10%过硫酸铵280 μ L, TEMED 26 μ L, 摇匀后水平灌胶, 排除气泡, 立即插上68孔梳子, 放置30 min。将玻璃板放到电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)中, 向电泳槽中加入适量1× TBE缓冲液, 拔出梳子, 取5 μ L扩增产物与1 μ L 6× 上样缓冲液混合均匀, 上样。恒定电压180 V电泳分离1.5 h。电泳结束后, 将聚丙烯酰胺凝胶用蒸馏水漂洗2次。加入800 mL 0.1%的AgNO3溶液染色20 min, 用蒸馏水漂洗2次。加入800 mL显影液(12 g氢氧化钠溶液, 0.152 g四硼酸钠)和1 mL甲醛, 当凝胶上出现清晰的条带后用蒸馏水漂洗10 s。取出凝胶至显影灯上, 拍照。

2 结果与分析
2.1 石斛基因组DNA检测

用1%的琼脂糖凝胶检测石斛基因组DNA纯度, 取5 μ L提取的石斛基因组DNA溶液和1 μ L 6× 上样缓冲液混合均匀后点样, 标准DNA分子量选用15 K Marker(北京全式金公司), D260/D280在1.8~2.0, 无蛋白质、RNA污染, 电泳结果如图1。

图1 部分石斛杂交群体F2代单株基因组的DNA电泳
M为Marker; 1~12分别为F2代群体的前12个单株

2.2 石斛SSR引物筛选结果

从320对SSR引物中初步筛选出57对条带清晰、有差异的引物用于后续石斛杂交群体的鉴定(图2)。

图2 部分引物的筛选电泳
29~1 147分别表示图中所示27对引物来源于筛选所得57对可用于杂交后代多态性鉴定的引物

2.3 SSR引物带型分析

从57对SSR引物中筛选出3对特异性SSR引物可用于石斛杂交群体F2代真杂交种的鉴定。3对SSR引物详细信息见表1。

表1 筛选出的3对引物信息

通过电泳图分析(图3), 我们将杂交群体单株的带型分为真杂交种型、父本型、母本型、缺失型[11]。同时具有父本和母本一条或一条以上特征带型的为真杂交种; 与母本带型相同的为母本型; 与父本带型相同的为父本型; 与父本或母本带型相似但缺失部分条带的为缺失型。若杂交群体F2代中单株带型为真杂交种型, 可认定为真杂交种; 若杂交种的带型为缺失型、父本型或母本型, 则需要用其他引物进一步判断。

图3 SSR引物图谱的带型
A, 真杂交种型; B, 母本型; C, 父本型; D, 缺失型

2.4 石斛杂交群体F2代真杂交种的鉴定

引物DNtSSR013、DNtSSR147、DNtSSR150对石斛杂交群体F2代扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳如图4~6。

图4 DNtSSR013对金钗石斛(♀)× 铁皮石斛(♂)杂交种F2代(1-131)的扩增电泳
M表示; 1~131分别表示从F2代中随机挑选的131个单株。图5~6同

图5 DNtSSR147对金钗石斛(♀)× 铁皮石斛(♂)杂交种F2代的扩增电泳

图6 DNtSSR150对金钗石斛(♀)× 铁皮石斛(♂)杂交种F2代的扩增电泳

利用筛选出的3对引物对铁皮石斛、金钗石斛2个亲本及131个杂交群体F2代进行鉴定。首先用引物DNtSSR013进行鉴定, 在250~280 bp处共有3条带, 母本有2条特征带, 父本有1条特征带, 在杂交群体F2代中同时具有父本、母本特征带的有85个单株, 鉴定为真杂交种。剩余的46个单株中有19个单株为父本型, 27个单株为缺失型, 因为用一对引物鉴定石斛杂交群体有其局限性, 这些无法鉴定为真杂交种的单株需要用其他引物进一步进行鉴定(图4)。其次用引物DNtSSR147对杂交群体F2代进行鉴定, 在160~180 bp处共有3条带, 母本有1条特征带, 父本有2条带, 在剩余的46个单株中同时具有父本、母本特征带的有8个单株, 鉴定为真杂交种(图5)。最后利用引物DNtSSR150进一步鉴定, 在200~250 bp处共有3条带, 母本有1条特征带, 父本有2条特征带, 从剩余的38个单株中鉴定出26个单株同时具有母本、父本的一条特征带, 鉴定为真杂交种(图6)。

利用引物DNtSSR013、引物DNtSSR147和引物DNtSSR150三对特异性SSR引物从131个杂交群体F2代中共鉴定出119个单株为真杂交种, 真杂交种单株占杂交群体总数的91%, 因此利用SSR标记对石斛杂交群体进行真杂交种的鉴定是可行的。在杂交群体F2代中个别单株出现父母本都不具有的新条带, 分析其原因可能是在配子形成过程中, 减数分裂时同源染色体发生配对和交换或在染色体复制过程中部分碱基发生基因突变引起的[10]。

3 小结与讨论

本研究从320对SSR引物中筛选出了3对特异性SSR引物用于铁皮石斛、金钗石斛2个亲本和131个杂交F2代单株真杂交种的鉴定。DNtSSR013、DNtSSR147和DNtSSR150三对特异性引物将杂交群体扩增带型分为真杂交种型、母本型、父本型、缺失型, 并从131个杂交群体F2代中鉴定出119个真杂交种, 真杂交种占杂交群体的91%。通过多对SSR引物组合能够快速准确的鉴定出真杂交种, 因此利用SSR分子标记技术鉴定石斛杂交群体是可行的, 提高了检测的准确度, 并为铁皮石斛和金钗石斛的遗传图谱构建, 石斛多糖和石斛碱等活性成分QTL定位奠定了基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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