芥菜种质资源分子聚类分析
宋慧, 任锡亮*, 张香琴
宁波市农业科学研究院蔬菜研究所 宁波市瓜菜育种重点实验室,浙江 宁波 315040
通讯作者:任锡亮(1980—),男,山东昌乐人,高级农艺师,硕士,主要从事十字花科蔬菜遗传育种与栽培技术工作,E-mail:xl_ren@126.com

作者简介:宋慧(1979—),女,甘肃兰州人,副研究员,博士,主要从事瓜菜分子育种与生物技术工作,E-mail:975281674@qq.com

摘要

为了明确宁波市农业科学研究院芥菜种质资源的遗传多样性,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)和简单重复序列(SSR)分子标记对41份芥菜种质进行聚类分析。8个RAPD和10个SSR差异引物在供试材料中共扩增出30个多态性位点,两种标记的多态性比例分别为3.04%和3.90%。聚类分析将供试材料分为9种类型,材料间遗传相似系数为0.31~1.00,同类型之间差异小,不同类型之间差异大。育种时应尽量选择不同类型、遗传相似度低的芥菜相互配组,提高育种效率。

关键词: 芥菜; RAPD; SSR; 聚类分析
中图分类号:S637 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2019)02-0226-03

芥菜(Brassica juncea)是十字花科芸薹属草本植物, 是全国各地普遍栽培的常用蔬菜, 特别是南方地区, 芥菜是当地的特色资源和支柱型产业, 对增加当地农民的经济收入有重要作用。同时, 我国是芥菜的原产地, 拥有1 000多份各具特色的芥菜种质[1], 这为培育丰产优质、成熟期短、抗病虫、耐逆、适应性强的优质芥菜品种提供了丰富的育种材料[2, 3]。旦巴等[4, 5, 6]和宋伟林等[7]先后利用随机扩增多态性DNA(polymerase chain reaction, RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)和相关序列扩增多态性(sequence— related amplified polymorphism, SRAP)等标记对西藏地区野生芥菜资源进行遗传多样性分析, 发现西藏特殊的地理环境和复杂的地貌使得当地资源变异丰富, 分子聚类结果与种质地理位置密切相关。蒲晓斌等[8]和徐爱遐等[9]对我国西南、西北、西部及北部地区芥菜资源和品种进行资源评估, 聚类结果遵循地理和生态环境规律, 为芥菜种质资源搜集提供了依据。乔爱民等[10]和陈发波等[11]研究表明, 芥菜变种间存在遗传多样性, 并呈现地域分布规律。

宁波市农业科学研究院自开展芥菜遗传育种以来, 除了搜集江浙一带农家品种, 还引进大量芥菜资源, 经过历年繁育配组, 材料品目繁多、来源模糊、表型鉴定工作繁重, 极不利于亲本选配。曾川等[12]在对三峡库区芥菜品种聚类分析后, 认为试验材料来源比较狭窄或者模糊的情况下, 分子标记能够更准确地区分材料间遗传距离。本研究利用分子标记技术对宁波市农业科学研究院芥菜种质资源进行聚类分析, 梳理材料间亲缘关系, 为进一步鉴定和利用种质材料提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料

宁波市农业科学研究院蔬菜研究所十字花科课题组保存的41份优质特异芥菜种质资源。

1.2 DNA提取

取芥菜幼叶, 利用CTAB法提取DNA, 利用1%琼脂糖凝胶电泳和微量核酸浓度测定仪(K5600)检测DNA浓度和质量, 要求电泳条带清晰无弥散, A260/280为1.7~1.8。

1.3 RAPD和SSR扩增与检测

RAPD引物参考蒲晓斌等[8], SSR引物参考巴旦等[6]和陈发波等[11]报道的序列, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用康为世纪生物科技有限公司2× Taq MasterMix(Day)PCR混合液, 按照说明书调整反应体系为10 μ L:5 μ L 2× Taq MasterMix(Day)、0.4 μ L引物(5 mmol· L-1)、1 μ L DNA(10 ng· μ L-1), 加ddH2O至10 μ L。PCR扩增程序为:94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 37 ℃(RAPD)/55 ℃(SSR) 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环; 72 ℃ 2 min。RAPD和SSR的PCR产物分别用1%普通琼脂糖凝胶和2%MS-6高分辨率琼脂糖凝胶(Takara)电泳, 凝胶成像系统观察扩增产物。

1.4 数据分析

根据琼脂糖凝胶电泳结果, 统计条带清晰、样品间有多态性的位点, 相同迁移位点扩增出条带的记为“ 1” , 无条带记为“ 0” , 建立0和1矩阵。计算标记多态信息量, 利用NTSYS-pc2.10e软件处理数据, 绘制聚类图。多态性比例=(多态性位点/扩增位点)× 100%。

2 结果与分析
2.1 差异引物的多态性

试验共使用48个RAPD和98对SSR标记, 分别扩增395和462个位点, 平均每个引物扩增8.2和4.7个条带。筛选到8个RAPD和10个SSR差异引物, 在41份芥菜种质中扩增出30个多态性位点, 2种标记的多态性比例分别为3.04%和3.90%, SSR标记多态性比RAPD的高(表1, 图1)。

表1 RAPD和SSR标记在41份芥菜种质中的多态性

图1 SSR引物在41份芥菜材料中的扩增

2.2 41份芥菜种质聚类

通过计算41份材料间的遗传相似系数绘制聚类图, 结果(表2, 图2)表明, 材料间遗传相似系数为0.311.00, 以0.78为阈值, 可以将供试材料分作9种类型。其中, 第Ⅲ 类包含芥菜种质最多, 有16份, 第Ⅱ 、Ⅵ 、Ⅶ 和Ⅷ 类分别只包含1份芥菜, 其他各类包含2~7个芥菜材料。第Ⅸ 类与第Ⅰ 类遗传距离最远, 差别最大; 第Ⅸ 类中的9号材料与其他各类相似系数均较小(0.56~0.62), 是41份芥菜材料中差异最大的材料, 9号与第Ⅰ 类37号相似系数最小(0.31)、遗传距离最大。根据分析结果, 可以选择不同类型、遗传相似系数小的芥菜相互配组, 利用杂种优势选育品种。

表2 供试41份芥菜种质聚类结果

图2 41份芥菜种质材料的聚类

3 小结

遗传多样性是反映育种材料遗传变异的重要指标[13], 遗传多样性丰富, 说明种质类型多样, 遗传差异较大, 在品种选育及改良中有更多可选择和利用的基因。利用聚类分析明确作物种质资源的遗传多样性及其变化趋势, 有助于正确选择亲本, 较好地利用种质资源。分子标记技术在芥菜品种亲缘关系[14, 15, 16, 17]和种质遗传多样性[18, 19]分析中应用广泛。陈发波等[11]利用SSR标记检测到16份芥菜变种间的遗传相似系数为0.41~0.75, 平均值为0.6, 说明芥菜变种间存在一定的遗传多样性; Qi等[20]利用40对AFLP引物对中国芥菜16个变种的亲缘关系进行分析, 其遗传相似系数为0.63~0.88。本试验利用RAPD和SSR引物检测到41份芥菜种质间遗传相似系数为0.31~1.00, 材料间遗传变异较丰富, 说明宁波市农业科学研究院近年来搜集引进的芥菜种质差异较大, 蕴含丰富的遗传基因。在实际应用中, 4、13、14和28等4份材料, 由于收集的时间、地点和获得途径不同, 虽然外观表型相似, 但不能完全确定是否是同一个材料, 对用作亲本一直存在疑虑。本实验将这4份材料聚为一类, 有效地解决了这个问题, 如此可以避免使用同类材料配组, 减少育种消耗。此外, 我们选择14号转育成的雄性不育系为母本, 分别与来自不同类群的8号和11号杂交, 育成了甬雪3号[浙(非)审蔬2012008]和甬雪4号[浙(非)审蔬2014002]雪里蕻。这2个品种表现生长势强、产量高、抗病毒病, 杂种优势非常明显, 显示了根据聚类结果选配亲本的优势。甬雪3号和甬雪4号雪里蕻杂交新品种的推广应用, 受到了种植基地的欢迎。

The authors have declared that no competing interests exist.

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