1.1.1 酸奶

随机抽取汕头市市售酸奶(100 mL装)2瓶, 保质期25 d。官方信息标注该酸奶只含副干酪乳杆菌。本实验在酸奶距离生产日期12 d时进行。

1.1.2 培养基

MC培养基购自环凯微生物科技公司。将MC培养基干粉32.4 g和琼脂粉6 g溶于400 mL蒸馏水中, 搅至溶解, 于121 ℃高压灭菌15~20 min。摇晃锥形瓶, 使碳酸钙均匀分布, 待其冷却至约70 ℃, 于超净工作台上打开瓶塞, 注入一次性培养皿中约15 mL, 待培养基凝固。将制备好的培养基于4 ℃冰箱内保存待用。

1.2.1 不同pH盐酸的制备

取pH值1的灭菌盐酸100、10 μ L, 分别加入900、990 μ L的灭菌生理盐水, 配制成pH值2和3的盐酸^[4]。

1.2.2 样品前处理

试验设置酸处理组(pH值为1、2、3), 对照组, 共4个处理, 每个处理3个重复。酸处理组:取3份100 μ L的酸奶(酸奶温度为4 ℃), 分别加入pH值1、2、3的灭菌盐酸900 μ L。对照组:取100 μ L的酸奶(酸奶温度为4 ℃), 加入900 μ L的灭菌生理盐水。每个组分别设置3个重复。为模拟酸奶在胃内停留的时间, 将样品充分混匀后, 37 ℃摇床振荡30 min^[5]。

1.2.3 样品的稀释涂布

取各处理样品, 加入灭菌生理盐水进行梯度稀释, 稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍。取各稀释样品200 μ L, 均匀涂于MC培养基上。取2个空白培养基, 一个未暴露于空气, 另一个暴露于空气中1 h。

1.2.4 细菌的分离培养

将试验组和对照组于37 ℃恒温下培养48~72 h。

1.2.5 细菌的鉴定

对具有乳酸菌典型特征的菌落, 用接种环在培养基上挑取2~3个单菌落进行革兰染色镜检。乳酸杆菌在MC培养基中菌落特征为菌落较小, 白色或淡粉色, 边缘不太整齐, 可有淡淡的晕, 直径(2± 1)mm。乳酸杆菌镜下菌体形态呈长杆状或短杆状, 且大多为两两相连排^[6]。结合菌落特征和镜检特征, 可确定乳酸杆菌。

1.2.6 数据统计

对平板上符合乳酸杆菌菌落特征的菌落进行肉眼计数, 并记录计数结果, 计算每个处理条件下的平均菌落数。选取菌落数为30~300的平板, 计算未稀释样品的活菌浓度及存活率。

实验组所有培养基均长出具有乳酸菌特征的菌落, 对其进行粗略计数, 可知各组随稀释度增大, 菌落数量明显下降; 稀释度较小, 菌落分布与涂布轨迹相吻合。菌落特征为圆球形稍隆起, 直径约1 mm, 淡粉色, 表面光滑, 边缘不太整齐, 半透明, 与文献报道的乳酸菌特征相同^[6]。镜下特点为革兰染色阳性, 短杆状, 单生或两两相连, 偶V字排开, 无荚膜无芽孢。对照组中未暴露于空气的培养基无菌落生成, 暴露于空气1 h的培养基长有许多杂菌。综上, 可确定实验组中的菌落为乳酸菌。

采用10倍梯度稀释在37 ℃恒温下对乳酸菌培养48~72 h, 得到不同处理条件下的平均菌落数(表1), 并计算酸奶中乳酸菌的活菌浓度和存活率(表2)。

表1

表1

表1 不同pH处理下酸奶中菌落计数 稀释度 对照组 酸处理组 pH值1 pH值2 pH值3 10-2 — 3 696 不可计数 10-3 不可计数 0 44 748 10-4 1 160 0 12 167 10-5 402 0 0 15 10-6 33 — — — 注:不可计数是指通过肉眼难以进行准确计数。

表1 不同pH处理下酸奶中菌落计数

表2

表2

表2 不同pH处理下酸奶中乳酸菌的活菌浓度和存活率 pH值 活菌浓度/mL-1 存活率/% 对照组 1.65× 108 100 1 1.50× 103 9.09× 10-4 2 2.20× 105 0.13 3 8.35× 106 5.06

表2 不同pH处理下酸奶中乳酸菌的活菌浓度和存活率

由表2可知, 与对照组相比, 酸处理组的活菌数均显著降低。结果表明, pH值1~3的酸性环境均能抑制乳酸菌的生长; 当pH值≤ 3以下时, pH值越小, 抑制作用越强。乳酸菌具有一定的耐酸能力, pH值3时耐酸能力相对较好, pH值1时耐受能力相对较差。