超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肝中3种β-受体激动剂残留

引用本文

沈东强, 刘标. 超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肝中3种β-受体激动剂残留[J]. 浙江农业科学, 2019,60(2):271-273 复制到剪切板

doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20190232
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超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肝中3种β-受体激动剂残留

沈东强, 刘标

湖州市农产品质量管理站,浙江湖州 313000

作者简介:沈东强(1991—),男,浙江湖州人,助理工程师,本科,从事农产品质量安全检测工作,E-mail:1207900102@qq.com。

摘要

建立猪肝中3种β-受体激动剂克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。3种β-受体激动剂在0.1~10.0 μg·L^-1呈现良好线性关系,相关系数大于0.998,检出限为0.002 8~0.011 0 μg·kg^-1,定量限为0.009 3~0.038 0 μg·kg^-1,加标回收率在86.9%~116.8%,相对标准偏差在0.67%~3.41%,分析在7 min内完成。建立的方法操作简单,灵敏度高,重复性好,可用于肉类样品中β-受体激动剂残留的测定。

关键词: 超高效液相色谱-串联质谱; 猪肝; β-受体激动剂;

中图分类号:O657.63;TS251.7 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2019)02-0271-03

β -受体激动剂是一类人工合成的苯乙醇胺类物质, 又称“ 瘦肉精” , 能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长^{[1, 2, 3]}。β -受体激动剂在动物性食品中的残留时间较长, 会严重影响人类健康。因此, 我国农业部第196号和235号公告均禁止β -受体激动剂类药物作为饲料添加剂用于畜牧业。

目前, 有关报道的动物源性食品中β -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^{[4, 5, 6]}、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^{[7, 8, 9]}和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10, 11, 12, 13]}。ELISA法无法精准定量, GC-MS法需要衍生, 步骤繁琐, 且不适用于多种目标物的同时测定, HPLC-MS/MS法无需衍生、检出限低、灵敏度高, 但前处理过程比较复杂。本文在现有的基础上, 优化了前处理步骤, 采用岛津超高效液相色谱仪(LC-30A)和三重四级杆串联质谱仪(LCMS-8050)联用技术测定β -受体激动剂药物残留, 分析准确, 效率高, 为当前β -受体激动剂检测领域提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-30A超高效液相色谱仪、LCMS-8050三重四级杆串联质谱仪, 日本岛津公司; N-EVAP氮吹仪, 美国Organomation公司; T25匀浆仪, 德国IKA公司; SKY-110WX水浴摇床, 广州沪瑞明仪器有限公司; MS1涡漩式混合器, 上海珂淮仪器有限公司。

甲醇(色谱纯), 甲酸(色谱纯), 水(超纯水), Oasis MCX阳离子交换柱(60 mg· (3 mL^-1))。克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司, 纯度≥ 99%, 莱克多巴胺-D3购自加拿大CDN isotopes公司, 纯度≥ 98%。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

标准物质分别为克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇。用甲醇配制成1 μ g· mL^-1混合标准储备溶液, -18 ℃避光保存。临用时, 用0.1%甲酸水溶液将1 μ g· mL^-1混合标准储备溶液依次稀释成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μ g· L^-1浓度的混合标准工作液。

同位素内标物分别为克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3。用甲醇配制成100 μ g· mL^-1的混合内标储备液, -18 ℃避光保存。临用时, 用0.1%甲酸水溶液将100 μ g· mL^-1混合内标储备液进行适当稀释。

1.2.2 样品前处理

准确称取2.0 g(精确至0.01 g)经捣碎的猪肝样品于50 mL离心管中, 加入250 μ L 100 ng· mL^-1内标液和8 mL 0.2 mol· L^-1 pH值5.2乙酸铵溶液, 充分混匀, 再加入50 μ L β -葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液, 振荡混匀后, 37 ℃水浴水解16 h后取出冷却, 10 000 r· min^-1离心5 min, 取出上清液, 下层溶液中加入8 mL 0.1 mol· L^-1高氯酸溶液, 振荡提取2 min, 10 000 r· min^-1离心5 min, 合并2次上清液, 混匀, 待净化。

依次用3 mL甲醇和3 mL水活化MCX固相萃取柱, 然后取上清液过柱, 弃去滤液, 再依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗, 弃去滤液, 最后用2.5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 45 ℃氮吹吹至近干, 用0.1%甲酸水溶液定容至5 mL, 漩涡混匀1 min, 过0.22 μ m有机相滤膜, 供HPLC-MS/MS分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱:Shim-pack GISS C₁₈柱(2.1 mm× 100 mm, 1.9 μ m); 柱温:40 ℃; 流动相A:0.1%甲酸水溶液, 流动相B:甲醇; 流速0.3 mL· min^-1; 进样体积10 μ L。

梯度洗脱, B相初始浓度3%, 洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.4 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI⁺), 离子源接口电压4 kV, 雾化气为氮气(3.0 L· min^-1), 干燥气为氮气(10 L· min^-1), 碰撞气为氩气, 脱溶剂管温度250 ℃, 加热模块温度400 ℃, 接口温度300 ℃, 喷雾针距离1.0 mm, 扫描模式为多反应监测(MRM), 驻留时间100 ms, MRM 参数见表2。

表 2 MRM 参数

2 结果与分析

2.1 线性范围

将浓度0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μ g· L^-1的混合标准工作液进行测定, 内标法定量。以待测物与内标物的浓度比为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制校准曲线, 线性方程及相关系数见表3。

表3 3种β -受体激动剂校准曲线参数

2.2 精密度

配制0.2、0.5、5.0 μ g· L^-1浓度β -受体激动剂标准溶液, 平行测定6次, 3种化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.018 0%~0.089 7%和0.67%~3.41%, 结果表明仪器精密度良好(表4)。

表4 重复测定的精密度

2.3 灵敏度

配制0.1μ g· L^-1β -受体激动剂的标准溶液进样, 根据S/N=3和10计算检出限和定量限(表5)。

表5 0.1μ g· L^-1 β -受体激动剂的灵敏度实验

2.4 回收率

取猪肝样品, 添加3个浓度做回收实验, 平行4次, 结果显示见表6。

表6 加标回收实验结果

3 小结

本研究建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪(LC-30A)和三重四级杆串联质谱仪(LCMS-8050)联用测定猪肝中3种β -受体激动剂的方法。考察了甲醇和乙腈作为流动相, 甲醇分离度和灵敏度都高于乙腈; 考察了PCX小柱和MCX小柱的净化效果, MCX小柱能更大程度地去除杂质, 达到更好的净化效果。综上, 通过方法验证, 符合现有标准的要求, 操作简单, 灵敏度高, 效率高, 可用于动物源性食品中β -受体激动剂的日常检测。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献:

文献选项

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... ,能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长^[1,2,3] ...

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... ,能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长^[1,2,3] ...

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... ,能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长^[1,2,3] ...

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... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

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... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

2005

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王建平, 沈建忠. 猪肝和猪尿中沙丁胺醇和克伦特罗残留的酶联免疫吸附检测法研究[J]. 畜牧兽医学报, 2005, 36(4): 397-401.

The β 2 -agonist, salbutamol (SAL) was linked to bovine serum albumin(BSA) using the mixed anhydride method and the anti-SAL serum was acquired in rabbits against the conjugate. The optional dilution of the anti-SAL serum was 1∶6 400 by the indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and the anti-SAL serum has the cross-reactivity of 110% with Clenbuterol (CL). Then an indirect competitive ELISA, which can detect SAL and CL simultaneously, was developed. The limit of detection for SAL was 0.48 ng/mL with the range of detection 0.48 ng/mL~8.0 μg/mL and the limit of detection for CL was 0.43 ng/mL with the range of detection 0.43 ng/mL~7.3 μg/mL. The recovery rates ranged from 72.2% to 84.8% for detecting SAL fortified level of 1~50 ng/g (ng/mL) in swine liver and swine urine, the coefficients of variation was 4.2%~28.3%; the recovery rates ranged from 84.3% to 103.4% for detecting CL fortified level of 1~50 ng/g (ng/mL) in swine liver and swine urine, the coefficients of variation was 0.3%~35.5%.

采用混合酸酐法将沙丁胺醇与牛血清白蛋白偶联，并免疫家兔制备抗沙丁胺醇抗血清。以间接ELISA法测定血清效价，测得抗血清最佳工作浓度为1∶6 400，该抗沙丁胺醇抗血清对克伦特罗有110%的交叉反应性。建立了能够同时检测SAL和CL的间接竞争ELISA方法，该方法对沙丁胺醇的检测范围为0.48 ng/mL~8.0 μg/mL，对克伦特罗的检测范围为0.43 ng/mL~7.3 μg/mL，对沙丁胺醇的检测灵敏度为0.48 ng/mL，对克伦特罗的检测灵敏度为0.43 ng/mL。在猪肝和猪尿中添加1~50 ng/g（ng/mL）的沙丁胺醇，添加回收率为72.2%~84.8%，变异系数为4.2%~28.3%，在猪肝脏和猪尿中添加1~50 ng/g（ng/mL）的克伦特罗，添加回收率为84.3%~103.4%，变异系数为0.3%~35.5%。

... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

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岳韩笑, 雷雯, 杜晓宁, 等. 同位素稀释-气相色谱-串联质谱法测定猪肉中残留的4种β-受体激动剂[J]. 质谱学报, 2018, 39(1): 61-68.

采用同位素稀释质谱法,结合固相萃取技术,建立了猪肉中克伦特罗、妥布特罗、溴布特罗、沙丁胺醇等4种β-受体激动剂残留量的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)检测方法。向绞碎的猪肉中加入同位素内标克伦特罗-D9、妥布特罗-D9、溴布特罗-D9,经β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解,醋酸铵缓冲溶液提取,高氯酸调pH,HLB-MCX固相萃取柱串联净化,用N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)衍生化后,进行GC-MS/MS测定,使用内标法定量。结果表明,猪肉中添加2.5~35.0μg/kg水平的β-受体激动剂,回收率为92.2%~112.8%,批内变异系数(CV)为1.0%~12.6%,批间变异系数(CV)为1.9%~13.2%。4种β-受体激动剂的线性范围为1.35~158.00μg/L,相关系数R2≥0.999 7,方法最低检测限为0.13~0.40μg/kg,最低定量限为0.40~1.27μg/kg。该方法精密度好、灵敏度高,可简便、准确地测定猪肉中4种β-受体激动剂的残留量。

... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

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... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

2008

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吴平谷, 陈慧华, 王强, 等. 气相色谱-质谱法测定动物组织中残留的10种β₂-兴奋剂[J]. 色谱, 2008, 26(1): 39-42.

A method for multi-residue analysis of β2-agonists, mabuterol, terbutaline, carbuterol, clenbuterol, cimaterol, salbutamol, clenpenterol, isoxsuprine, bambuterol and ractopamine in animal tissues using gas chromatography-mass spectrometry, based on isotope dilution and solid phase extraction has been developed. The homogenized sample was spiked with isotope-labeled internal standards, D9-clenbuterol, D3-salbutamol and D5-ractopamine, extracted with anhydrous alcohol, defatted using hexane, and cleaned-up on an SLS cartridge, and derivatized with N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoro acetamide （BSTFA）+1%trimethylchlorosilane （TMCS）. The experimental results indicated that the recoveries were 72.8%-110.3%, and the relative standard deviations were 1.2%-11.3% in blank samples spiked with the above mentioned agonists at 2.0-10.0 μg/kg, and the corresponding detection limits were 0.5-1.0 μg/kg.

1.Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310009, China; 2.Zhejiang Provincial Inspection Center for Animal Products Quality, Hangzhou 310020, China; 3.Zhejiang Provincial Agricultural Scientific Academy, Hangzhou 310020, China

采用同位素稀释法并结合固相萃取技术,建立了动物组织中马布特罗、特布他林、卡布特罗、克伦特罗、西马特罗、沙丁胺醇、clenpenterol、苯氧丙酚胺、班布特罗、莱克多巴胺等10种β2-兴奋剂残留的气相色谱-质谱(GC-MS)检测方法。动物组织中添加同位素内标D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇、D5-莱克多巴胺,经无水乙醇提取、正己烷脱脂、SLS离子交换固相萃取柱净化后，用双三甲基硅基三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷衍生，再进行GC-MS测定,内标法定量。结果表明,动物组织中添加2.0～10.0 μg/kg水平的β2-兴奋剂,回收率为72.8%~110.3%,相对标准偏差为1.2%~11.3%,最低检测限为0.5～1.0 μg/kg。

... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

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马俊美, 孙磊, 刘茁, 等. 在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉和羊肉中10种β-受体激动剂[J]. 肉类研究, 2018, 32(5): 19-25.

建立在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱检测猪肉及羊肉中10种β-受体激动剂的全自动分析方法。样品于37℃酶解16 h后,经MCX在线固相萃取小柱净化,采用XBridge C_(18)色谱柱分离,以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾电离正离子模式下,采用多反应监测模式检测,内标法定量。结果表明:10种β-受体激动剂在0.01～10.00 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999 0;检出限为0.004～0.040μg/kg,定量限为0.02～0.20μg/kg;方法回收率为76.5%～107.7%,相对标准偏差小于10%。该方法分析速度快、灵敏度高,可用于猪肉和羊肉中10种β-受体激动剂的定性及定量分析。

... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

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金玉娥, 郭德华, 郑烨, 等. 液质联用仪测定动物源性食品中11种β₂-受体激动剂的研究[J]. 质谱学报, 2007, 28(4): 193-201.

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1.Shanghai Municipal&n

建立了同时检测11种 β <

... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

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郑百芹, 李爱军, 张建民, 等. 液相色谱-串联质谱法测定猪肉中3种β-受体激动剂类药物残留[J]. 中国畜牧兽医, 2012, 39(3): 224-227.

... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...

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白凌, 陈大舟, 白凌, 等. 液相色谱-质谱法检测肝脏中5种β-受体激动剂[J]. 质谱学报, 2008, 29(1): 10-12.

建立了合理、可靠的液相色谱-质谱联用测定β-受体激动剂的方法.样品经5%高氯酸溶液提取,反相C18小柱净化,采用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱分离,以0.1%乙酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行等度洗脱.通过液相色谱-质谱以MRM方式检测,测得5种β-受体激动剂的检测限为 0.4～1.2 ug·kg-1.对肝脏进行添标回收实验,平均回收率为77.2%～95.6%.

... -受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[4,5,6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7,8,9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)^{[10,11,12,13]} ...