流感对人类健康威胁严重, 其发病率为各种传染性疾病之首, 是严重危害人类健康的重要传染病之一。据世界卫生组织报告, 全球每年约有6亿~l2亿人感染流感, 其中死亡人数高达50万~100万人, 给人类健康和经济造成了巨大危害和损失。特别是近年来人感染高致病性H5N1禽流感, 以及2009年在墨西哥暴发的甲型H1N1流感, 再一次给人们敲响了警钟, 人类流感的防控极为重要。流感病毒表面抗原时常发生变异^[11], 及时接种疫苗是预防流感最有效的方法。目前, 流感疫苗的主要生产介质是鸡胚, 然而由鸡胚来源的疫苗存在着质量难以控制、生产周期长、易引起过敏等问题, 一旦流感暴发, 其来源将成为瓶颈, 无法及时应对流感疫情。因此, 开发新的人用流感疫苗生产介质已成为疫苗生产的关键, 世界卫生组织(World Health Organization, WHO)推荐细胞是生产疫苗的优良介质。MDCK细胞系是1958年Madin等从美国一头Cocker Spanie母曲架犬的肾脏组织中分离培养建立得到的细胞^[12]。该细胞形态呈上皮细胞样, 贴壁生长, 可连续传代, 具有易培养、增殖快、流感病毒感染效率高等特点, 被用作流感病毒疫苗生产的重要细胞系。

牛血清是生物医药领域公认的培养细胞的一种重要原料, 含有丰富的细胞生长必需的营养成分, 如蛋白质、激素、生长因子、贴壁因子和多肽类物质等^{[13, 14]}, 支撑着细胞的生长和正常增殖, 为顺利进行细胞体外培养提供了必要的营养保障^{[15, 16]}。我国使用最多的是胎牛血清和新生牛血清, 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)是在屠宰怀孕母牛的时候, 通过心脏穿刺采血获取的胎牛血清; 新生牛血清(newborn bovine serum, NBS)是指出生14 h内未进食的健康新生牛采集分离的血清原料进一步精制而成^[17]。胎牛血清绝大部分的物质来源于母体, 含有丰富的胚胎发育过程中必需的一些生长因子和激素等; 新生牛血清的这些成分相对较少, 随着犊牛月龄的增长, 血清中的抗体、补体等成分增加, 而这些大分子蛋白质是一种异源物质, 给细胞增殖带来不利影响。大量的脂蛋白、纤维蛋白以及多肽类物质在低温保存解冻过程中会自然形成很多沉淀。有限稀释法是一种单细胞培养技术, 通过将细胞稀释至每孔只有单个细胞后进行培养而获得单克隆化细胞株的目的。该方法适用于细胞纯化, 突变细胞株的选择和分离, 是培养单克隆细胞株的常用方法^[10]。一个细胞克隆株中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞, 故称之为单克隆细胞(monoclonal cell)。本研究中新生牛血清培养的MDCK细胞中发现有少量的杂质悬浮于细胞液中, 细胞贴壁后杂质便贴附于细胞上, 影响细胞的生长和单细胞孔的标记。马桂兰等^[18]研究发现, 在培养单克隆细胞时, 细胞失去了群体效应支持, 生长变得艰难, 使用胎牛血清的效果比新生牛的更好。血清的质量直接关系到研究进度和生产效益, 血清选择不当可能会造成细胞增殖缓慢甚至导致细胞不增殖, 推迟科研进度, 导致不必要的损失。因此, 研究不同血清对有限稀释法制备单克隆细胞的影响具有很重要的意义。本研究血清对比结果显示, 使用胎牛血清制备MDCK单克隆细胞对细胞生长状态、生长速度及单细胞孔的标记角度更加理想。

细胞培养中使用的血清浓度一般为0.5%~30%^[19]。血清浓度过高会导致细胞生长过快, 相悖于MDCK细胞的正常生长周期; 浓度过低会导致细胞生长过慢甚至死亡^[20]。马萍等^[21]研究表明胎牛血清含量为5%~15%时, MDCK细胞形态正常, 细胞均能长成片。MDCK细胞在不同浓度的胎牛血清下生长趋势也有很大不同。本研究显示, MDCK细胞在低浓度血清培养条件下生长状态不佳。因此, 设定10%和15% 2个胎牛血清浓度, 探究其与制备MDCK单克隆细胞效率的相关性, 结果表明血清浓度与制备MDCK单克隆细胞效率二者之间高度相关, 有限稀释法利用15%胎牛血清浓度制备MDCK时效率明显提升。单孔细胞浓度是影响有限稀释法制备MDCK单克隆细胞株的重要因素。随着单孔细胞浓度的升高, MDCK单克隆细胞制备效率呈现先上升后快速下降的趋势。本研究结果显示, 单孔细胞浓度与制备单克隆细胞数目有正相关性, 在1个· 孔^-1时, 通过有限稀释法制备的单克隆细胞数目最多, 相比另外两浓度具有明显优势。与2个· 孔^-1的单孔细胞浓度相比, 0.5个· 孔^-1单孔细胞浓度时制备MDCK单克隆细胞株在单孔标记操作更加简单快速, 省时节力。

随着利用细胞大规模培养技术生产流感疫苗的研究热度越来越高, 高效制备MDCK单克隆细胞株也逐渐成为研究重点, 可相关实验参数条件均处于探索阶段。本研究采用有限稀释法制备MDCK单克隆细胞株, 胎牛血清浓度为15%, 96孔细胞培养板单孔接种密度为1个· 孔^-1时, 可以较高效制备MDCK单克隆细胞株。本研究建立的MDCK单克隆细胞库为开展MDCK细胞及流感细胞基质疫苗的研究提供了细胞资源, 探究了有限稀释法制备MDCK单克隆细胞的实验参数条件, 可为今后制备单克隆细胞并开展流感疫苗相关研究提供基础理论依据。