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郭德斌, 苏婷, 郭振, 毛春财, 卢素珍, 王辉. 鸭皮胶原蛋白肽的制备及抗氧化活性[J]. 浙江农业科学, 2019,60(7):1226-1229
doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20190748
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鸭皮胶原蛋白肽的制备及抗氧化活性
郭德斌1, 苏婷1, 郭振1, 毛春财1, 卢素珍2, 王辉2,*
1.江西煌上煌集团食品股份有限公司,江西 南昌 330200
2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047
通讯作者：王辉(1982—),女,山东聊城人,副研究员,博士,研究方向为农副产品精深加工和高值化综合利用,E-mail:503756510@qq.com。

作者简介:郭德斌(1982—),男,山东青岛人,工程师,硕士,研究方向为禽肉加工,E-mail:270832599@qq.com。

基金项目: 2017年度工信部《中国制造2025》绿色制造系统集成项目(Z135060009002)
摘要

以鸭皮为主要原料,采用湿法粉碎、碱性蛋白酶酶解技术进行鸭皮中胶原多肽的提取,以鸭皮胶原蛋白的水解度为主要指标,分别研究pH值、料液比、温度、酶用量和时间等因素对其的影响规律。通过正交试验结果确定鸭皮中胶原蛋白水解工艺的最佳条件为温度60 ℃,料液比1:20,加酶量7 000 U·g-1,pH值8.5,反应时间4 h,此时水解度为22.14%;在添加浓度为16 mg·mL-1时,其羟自由基清除能力、DPPH清除能力和还原力分别为65.22%、77.45%和79.36%;其分子质量分布为1 000~5 000 u的多肽占83.56%。

关键词: 鸭皮; 胶原蛋白肽; 碱性蛋白酶; 水解度; 抗氧化活性
中图分类号:S834 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2019)07-1226-04

鸭肉具有大补消热、利便除肿、消胀利脏等功效, 一直是餐桌上的上乘佳肴。鸭肉含有丰富的蛋白质、脂肪等营养物质, 尤其是蛋白质含量和品质比畜肉高, 脂肪、碳水化合物含量适中[1]。另外, 鸭皮中含有丰富的胶原蛋白, 是美容养颜、滋阴补肾的佳品。据报道, 鸭皮胶原蛋白的氨基酸组成和比例非常优越, 羟脯氨酸含量较高, 且胶原蛋白的结构与人体胶原蛋白结构比较相似, 是生产胶原蛋白的最佳原料[2]。

目前, 胶原蛋白质的提取技术主要有酸法[3]、碱法、酶法、水提法等等, 其中酸法、碱法和水提法的反应条件比较剧烈, 易使蛋白质上的氨基酸发生其他副反应, 影响胶原蛋白的品质。酶法具有效率高、反应温和、不破坏蛋白质的原始氨基酸结构等优点[4], 被广泛用于胶原蛋白的提取。鸭肉制品的加工是我国的传统产业, 在全国各地均有较多的消费群体, 但是关于鸭骨、鸭皮、鸭皮中胶原的研究较少, 仅有鸭骨成分和鸭骨糜加工等方面的研究报道[5]。肉鸭加工中还会产生鸭皮等副产物, 仅伊莉等[3]研发了酸法提取鸭皮胶原蛋白的工艺和技术。本文以鸭皮为主要原料, 以水解度和抗氧化活性为指标筛选最佳蛋白酶, 通过单因素和正交试验研究鸭皮胶原蛋白肽的最佳制备工艺, 并进行分子质量和抗氧化活性分析, 为鸭皮的高值化综合利用提供新方法。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器

鸭皮来源于江西煌上煌集团食品股份有限公司。2.4 L Alcalase碱性蛋白酶购于丹麦诺维信公司; 其他试剂均为国产分析纯。

U-2910紫外/可见分光光度计(日本日立公司); Synergy H1酶标仪(美国Bio-Tek公司); TGL-10C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂); TP-214型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司); Agilent 1100 HPLC(美国安捷伦科技技术有限公司); B-260型恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 处理设计

1.2.1 鸭皮的粉碎和脱脂处理

将新鲜鸭皮清洗干净, 采用胶体磨进行鸭皮的粉碎, 得到鸭皮糜, 然后以低沸点正己烷为提取剂, 采用溶剂脱脂技术进行鸭皮糜的脱脂, 使脂肪残留量低于5%(占干物质量)。

1.2.2 最适蛋白酶的选择

通过相关文献、市场销售和工艺需求, 分别从表1的4种蛋白酶中进行最适蛋白酶的选择, 比较不同酶对鸭皮糜的水解度, 水解度最高的酶为最适合酶。

表1 最适蛋白酶的酶解条件

1.2.3 鸭皮中胶原多肽的提取

以脱脂后的鸭皮糜为原料, 按照一定的料液比加入去离子水, 在一定温度和pH值条件下采用碱性蛋白酶进行水解, 以水解度为主要指标, 以料液比、温度、pH值、酶添加量和时间为主要影响因素, 通过单因素和正交试验确定鸭皮中胶原多肽的最佳提取工艺。

单因素试验:液料比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25和1:30; 加酶量分别为4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 U· g-1; 温度分别为50、55、60、65、70 ℃; pH值分别为7、7.5、8.0、8.5、9.0; 水解时间分别为1、2、3、4、5、6 h。

根据单因素试验结果, 进行4因素3水平正交试验设计:1、2、3水平的酶解温度(A)分别为55、60、65 ℃, 液料比(B)分别为1:18、1:20、1:22, 加酶量(C)分别为6 500、7 000、7 500 U· g-1, pH(D)分别为8.0、8.5、9.0。

1.3 指标测定

采用甲醛滴定法[6]测定水解度。

将最佳工艺制备得到的鸭皮胶原多肽溶于去离子水, 用0.45 μ m的微孔滤膜过滤后, 采用高效体积排阻色谱法测定分子质量[7]。

羟自由基(· OH)清除能力的测定。分别取1.0 mL不同浓度的鸭皮胶原肽溶液加入5 mL的具塞试管中, 然后依次分别加入硫酸亚铁(2 mL, 1.8 mmol· L-1)、水杨酸-乙醇(1.5 mL, 1.8 mmol· L-1)、H2O2(0.1 mL, 8.8 mmol· L-1), 37 ℃孵化30 min; 然后取200 μ L反应液于96孔的酶标板上测量波长510 nm处的吸光度值Di, 空白样品为去离子水样品, 吸光度值为D0。羟自由基清除率(%)[8]=[(D0-Di)/D0]× 100。

还原力的测定。分别取2.0 mL不同浓度的多肽溶液移入10 mL的具塞比色管中, 然后依次加入2 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol· L-1, pH值6.6)、2 mL质量分数为1%的K3Fe(CN)6, 混合均匀, 于50 ℃水浴锅中反应20 min, 然后冷却至室温。随后加入2 mL质量分数10%的三氯乙酸, 混匀离心后取2 mL上清液, 加2 mL去离子水和0.4 mL 0.1% FeCl3, 混匀后于700 nm处测定Di。以去离子代替样品作为对照[9]。

DPPH清除能力测定。分别取100 μ L不同浓度的胶原多肽移至96孔酶标板, 然后加100 μ L 0.2 mmol· L-1的DPPH的乙醇溶液, 混匀, 在常温条件下避光反应30 min, 波长517 nm处测吸光度值D1。以95%乙醇代替DPPH溶液作为空白对照1(D0), 以去离子水代替胶原多肽为对照组2(D2)。DPPH清除率(%)[10]=(D2-D1)/(D2-D0)× 100。

2 结果与分析
2.1 蛋白酶的筛选

水解度和抗氧化活性是衡量胶原多肽制备效率和产品效果的2个主要指标[10]。本研究选择具有较强活性的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶为主要水解酶, 4种蛋白酶对鸭皮胶原多肽的水解效果和抗氧化活性如图1所示, 碱性蛋白酶的酶解效率较高, 且水解样品的羟自由基清除率、DPPH清除率和还原力均高于其他3种水解酶。因此, 本试验以碱性蛋白酶为最佳水解酶开展后续试验。

图1 不同蛋白酶对鸭皮胶原蛋白的酶解效果
同指标柱上无相同字母表示差异显著(P< 0.05)。图2~4同

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对鸭皮胶原水解度的影响

料液比是影响鸭皮胶原蛋白水解的重要因素之一。如图2所示, 随着料液比的增大, 鸭皮胶原蛋白的水解度呈增加的趋势, 且当料液比分别为1:15、1:20、1:25和1:30时, 其水解度变化不显著。出现这种现象的原因有2个, 一方面鸭皮糜本身含有一定的水分, 料液比1:15的条件下刚好使鸭皮糜达到最佳料液比; 另一方面, 在该条件下酶可以充分地与底物胶原蛋白接触和反应, 物料浓度太高时, 酶与底物不能充分接触, 物料浓度太低时, 酶与底物的接触面积也会相对减少[11]。

图2 料液比对鸭皮胶原蛋白水解度的影响

2.2.2 加酶量、温度对鸭皮胶原水解度的影响

加酶量和温度是鸭皮胶原水解的重要因素。由图3可知, 酶的添加量与水解度成正相关, 随着酶添加量的不断增加, 鸭皮胶原的水解度显著提高, 当酶加入量超过7 000 U· g-1后, 水解度无显著变化, 此时的反应达到平衡。主要是由于底物-酶的结合有一个最佳饱和度, 当未达到饱和时, 随着酶添加量增加, 水解度逐渐提高; 当二者达到饱和时, 酶的添加量对其水解度的影响减小。出现这种现象的原因可能是, 在蛋白质酶解初期, 底物和酶之间的相互作用达到饱和, 但是, 随着酶添加量的增加, 大部分反应底物被消耗, 而使其水解度降低。因此, 选取试验酶加入量的3个水平因素为5 000、6 000、7 000 U· g-1。随着温度的增加水解度呈现先增大后降低的变化趋势, 当水解温度为60 ℃时, 其水解度达到最大值, 说明底物为鸭皮糜时, 60 ℃为碱性蛋白酶的最佳酶解活性。

图3 加酶量和温度对鸭皮胶原蛋白水解度的影响

2.2.3 pH值和酶解时间对鸭皮胶原水解度的影响

由图4可知, pH值从7增加到9时, 水解度呈现先增加后降低的趋势, 当pH值为8.5时水解度达到最大。而随着酶解时间的延长, 水解度不断提高。酶解时间为1、2 h时, 水解度的升高速度最快, 因为蛋白酶在前期活性最高, 水解效率也最高。当时间超过5 h时, 水解度无显著变化, 这是因为当水解时间为1~5 h时, 鸭皮胶原蛋白呈饱和状态, 水解反应为零级反应, 反应向产物生成的方向进行, 当反应时间超过5 h, 反应达到平衡, 加上5 h以后蛋白酶的活性降低也会影响其水解度。

图4 pH值和反应时间对鸭皮胶原蛋白水解度的影响

2.3 正交试验结果

鸭皮胶原蛋白水解过程中的各个影响因素不是孤立发生的, 是具有一定的相互关联性的。因此, 要得到鸭皮胶原蛋白制备的最佳工艺, 必须进行酶添加量、料液比、反应温度、时间和pH等各个因素正交试验[12]。根据单因素试验结果, 选择固定酶解时间, 进行料液比、酶解温度、加酶量、pH值4个因素的正交试验。由表2和极差分析结果可知, 各因素对鸭皮中胶原蛋白水解度的影响大小为温度> 料液比> pH> 加酶量。鸭皮胶原水解的最佳工艺为温度60 ℃, 料液比为1:20, 加酶量7 000 U· g-1, pH 8.5, 反应4 h, 此时水解度为22.14%。

表2 各处理组合对水解度的影响
2.4 鸭皮胶原蛋白肽的抗氧化活性和相对分子质量分析

采用上述最佳工艺条件制备鸭皮胶原蛋白肽, 并进行其抗氧化和分子质量分析。如图5所示, 随着多肽浓度增加, 其抗氧化活性逐渐增大, 当添加浓度为16 mg· mL-1时, 其羟自由基清除能力、DPPH清除能力和还原力分别为65.22%、77.45%和79.36%。

图5 鸭皮胶原蛋白肽的抗氧化活性分析

利用分子排阻凝胶柱进行鸭皮胶原多肽的相对分子质量分析, 通过HPLC色谱中的出峰时间、面积, 以相对分子质量的对数对保留时间作图(图6), 得到相对分子质量校正曲线方程, 计算得出鸭皮胶原蛋白肽的相对分子质量为1 000~5 000 u, 该组分占83.56%; 1 000 u以下的多肽占16.44%。

图6 鸭皮胶原蛋白肽相对分子质量分析的HPLC图谱

3 小结

本研究以鸭皮糜为原料, 筛选了碱性蛋白酶作为鸭皮糜中胶原蛋白肽提取的主要蛋白酶, 并以水解度为主要指标, 确定了鸭皮胶原肽制备的最佳工艺条件为:温度60 ℃, 料液比为1:20, 加酶量7 000 U· g-1, pH值 8.5, 反应4 h, 此时水解度为22.14%。

本文工艺制备得到的鸭皮胶原肽具有一定的抗氧化能力, 当添加浓度为16 mg· mL-1时, 其羟自由基清除能力、DPPH清除能力和还原力分别为65.22%、77.45%和79.36%; 其相对分子质量为1 000~5 000 u, 该组分占83.56%, 1 000 u以下的多肽占16.44%。

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