DNA条形码是使用标准化的DNA标记进行物种准确鉴定的技术, 是运用变异较多的和已扩增成功的较短标准DNA条形码片段, 在生物种内特异性与种间多样性之间创建的身份鉴定系统, 从而实现对物种的快速、高效识别。Arnot等最早提出DNA条形码的概念, 但一直到2003年Hebert提出建立一个基于DNA条形码的数据库以实现物种的快速鉴定后, DNA条形码技术才得到了生物学界的普遍认可并得以快速发展^[4]。2004年, 美国建立了生物信息中心(NCBI)和生命条形码联盟(CBOL), 将物种条形码标准DNA存入了GenBank中, 在2009年国际生命条码实施之后, 一个基于所有真核生物DNA条形码数据库自动鉴定系统逐步建立。另外, 信息技术的发展为海量数据处理提供了工具, 推动了DNA条形码技术的标准化使用, 生命条形码协会和国际生命条形码计划还创建了大量针对各类群DNA条形码的数据库, 如ABBI、All-Lepsh和WoRMS等^[5]。

DNA是由4种碱基(A、T、G、C)按照一定的顺序构成的基因序列, 每个位点均有4种可能选择, 生物特有DNA条形码标签, 仅仅15个位点就可产生4¹⁵种选择^[1]。由于有的位点碱基受选择压力不随环境的变化而改变, 所以可以仅考虑蛋白质编码基因, 根据密码子通用的性质, 45个位点便可以形成10亿种不同序列。如今的DNA测序技术能够精准的检测一段几百bp长度的DNA序列, 理论上, 一段648 bp的DNA条形码足以鉴定所有物种。DNA条形码的原理是选择高度保守且在物种进化水平变异细微的DNA编码区或非编码区片段用以鉴定物种, 但是找到这种通用标准序列片段比较困难^[6]。目前COⅠ 、16S rRNA、18S rDNA、Cyt b、ITS、rbcSp为常用的几种通用片段^{[7, 8]}。

1.3.1 COⅠ 作为动物分类首选序列的优势

运用DNA条形码技术鉴定物种, 首先需要一个标准序列用以和样本的序列进行比对。理想的DNA条形码序列需符合以下标准。1)序列的两端保守, 能够设计用于扩增的通用引物。2)序列的变异速率适宜, 既能够区别不同物种的生物, 种内遗传变异又较小。线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ 基因目前被普遍认同为标准的动物DNA条形码序列^{[9, 10]}, 因其具有以下优势。1)mtCOⅠ 基因5’ 末端约648 bp的序列保守, 具引物扩增通用性^[4]。2)该基因无内含子且严格遵循母系遗传, 重组率低, 拥有较高的拷贝数, 从而将PCR扩增过程简单化^[3]。3)mtCOⅠ 序列具有较高的突变率, 其碱基可能组合数远大于物种数。4)mtCOⅠ 密码子第3位碱基的置换频率高, 使其进化速率约是12 s DNA和16S DNA的3倍, 具更多系统发育信息^[6]。5)mtCOⅠ 基因种间遗传距离基本小于1%, 远小于种间遗传距离。Hebert在提出DNA条形码概念时, 便运用COⅠ 序列分析了动物界11门13 320个物种, 其中可被明确鉴定的物种数占比高达98%^[9], 可见使用mtCOⅠ 基因作为标准序列的可行性。而目前COⅠ 序列更是被广泛应用于鱼类、贝类、昆虫类等物种的鉴定^{[11, 12, 13, 14, 15]}, 发挥了极大的作用。

1.3.2 其他DNA条形码序列

高等植物的线粒体基因的进化速率十分缓慢, 因此COⅠ 序列并不能够作为植物的通用DNA条形码, 通常使用cpDNA序列鉴定植物物种^[8]。然而, 研究结果显示, 目前全世界高等植物约有30万种, 且多倍体植物常见, 又具有高种间杂交率, 导致单基因组标记往往无法准确鉴别不同种植物。因此, 第三届国际DNA条形码学术大会确定了将叶绿体rbcL与matK的基因组合作为植物DNA标准条形码, 其对植物的鉴定率达到了72%^[6]; 同时将叶绿体trnH-psbA和ITS作为补充条形码^[16]。但植物标准DNA条形码至今没有确定。菌类由于结构十分简单, 仅形态鉴定几乎无法将其区分, 其条形码研究主要运用rDNA或某些功能蛋白基因, 如16S rDNA、ITS、微管蛋白基因等^[5]。

1.3.3 DNA条形码技术的优势与挑战

对物种的准确鉴定是描述生物多样性的基础。传统物种鉴定基于对物种的形态观察与解剖, 受物种生长发育的阶段与环境, 以及鉴定者个人素质的影响。DNA条形码技术则可以弥补传统鉴定法的不足。相对于传统法来说, 利用DNA条形码技术进行物种鉴定具有以下优势:1)由于物种生长时DNA序列并未发生变化, 因此DNA条形码技术不受个体发育阶段和生长环境的影响, 准确性较高; 2)操作技术简单, 通用性高, 可实现一次性对大量样本的鉴定, 对鉴定人员个人素质的要求不高; 3)对样本要求低, DNA样本仅0.1 g便足以进行鉴定, 且不需样本的高完整性, 即使样本被降解也可用于鉴定, 避免了鉴定人员的主观误差^{[17, 18, 19]}; 4)可将数据发送至BOLD数据库, 从而实现资源的全球性共享。然而由于部分物种可能存在种内分化过高、种间分化不足的现象, 种内与种间遗传距离可能重合, 导致鉴定的不准确; 同时, 叶绿体与线粒体遵循单亲遗传, 不利于鉴定杂交物种^[20]; 并且, 一些新形成的物种差异可能非常小, 能否运用DNA条形码技术鉴定这些物种仍存在争议。遗传学数据库的完备程度决定了DNA条形码技术鉴定物种的准确性^[21], 然而, 相对于庞大的生物物种数量来说, 目前BOLD等数据库收录的DNA序列数目实在过于渺小, 积极开发DNA序列是科研工作者们的必经之路。

帘蛤目属软体动物门、双壳纲。在我国, 帘蛤目动物分布十分广泛且数目繁多, 外形相似, 依靠形态学方法将其分类的难度非常大。使用DNA条形码技术分类则使分类难度大大降低。王琳楠等^[22]选取了帘蛤目16个物种110个个体进行研究, 测得其COⅠ 基因序列的种内平均遗传距离为0.010 6, 虽然裂纹哥特蛤的遗传距离达到了0.018 2, 但仍然在DNA条形码COⅠ 基因种内遗传距离2%的界限内; 种间平均遗传距离高达0.388 4, 远大于种内遗传距离, 完全符合作为DNA条形码基因序列所需满足的要求。将这些DNA条形码序列与BOLD中的已知序列对比, 匹配率达100%。该研究的分类结果与形态学鉴定结果相同, 验证了形态学鉴定的准确性。孟学平等^[23]通过计算发现, 长乐、漳州地区西施舌类群与其他地区的COⅠ 基因种内遗传距离过大, 从而证明了福建西施舌是西施舌的一个亚种。

珍珠贝亚目在双壳类软体动物中最具经济价值。冯艳微^[24]对扇贝科的8个种63个个体的mtCOⅠ 和16S rRNA的部分基因序列进行测序, 结果表明mtCOⅠ 种内遗传距离平均0.004 8, 种间遗传距离平均0.284; 16S RNA种内遗传距离平均0.001, 种间遗传距离平均0.231; 两者的种间遗传距离都远大于种内, 存在明显的条形码间隙, 能够有效鉴定扇贝科物种, 但比较而言, COⅠ 基因更适合作为珍珠贝亚目DNA条形码的标准基因。

贻贝目分布广泛, 具有较高的食用价值。以往的形态学鉴定法往往根据其壳形、刻纹、闭壳肌痕等特征进行分类, 难度较大。刘君采集了贻贝科3亚科、8属、11种共52个样品并扩增其COⅠ 基因^{[25, 26]}, 使用COⅠ 的通用引物能够成功扩增10个种的基因, 可见COⅠ 引物有较高适用性; 结果显示, 除凸壳肌蛤外, COⅠ 基因的种内遗传距离平均小于2%, 种间遗传距离均在20%以上, 最大可达60%左右, 完全符合Hebert提出的10x规则^[19]。且贻贝科COⅠ 基因的种间遗传距离明显大于其他生物类群, 可见COⅠ 基因序列十分适合作为贻贝科的DNA条形码标准序列。研究同时表明, 凸壳肌蛤之所以种内遗传距离过大, 是因为存在线粒体双单亲遗传模式, 父本线粒体的M和F类型都可能遗传给子代。因此试验时应尽量避免这种模式的干扰, 首选提取贝类的闭壳肌组织。

除上述贝类之外, DNA条形码技术在鉴别其他贝类时同样被广泛地运用。刘君等^[25]将DNA条形码技术应用于牡蛎科(Ostreidae)的48个样品, 得到30条COⅠ 序列和47条16S rDNA序列。经过研究表明COⅠ 基因能较好分辨各个种, 16S rDNA能较好的区分近缘种之外的大部分种类。经过遗传距离法分析证实, 在牡蛎科中的巨牡蛎属(Crassostrea)为代表的一些种类, 16S rDNA序列的遗传变异小于COⅠ 序列。由此证明, COⅠ 基因的使用效率大于16S rDNA。在对钉螺属(Oncomelania)的研究中, 徐玉梅等^[27]选取安徽分别代表长江上、中、下游的3个地区水域所采集的钉螺, 进行COⅠ 基因分析, 结果显示, 3种不同水域钉螺种类的一致性达到98%及以上, 表明基于COⅠ 基因的DNA条形码技术在钉螺科应用的有效性^[16]。