1.1.1 质粒与菌株

质粒pET-32a(+), 北京Solarbio科技有限公司; E.Coli DH5α , 日本TaKaRa公司; 基因工程菌E Coli BL21(DE3)pLysS, 北京全式金生物有限公司。

1.1.2 主要试剂

氨苄霉素(母液浓度100 mg· mL^-1, 使用时每100 mL培养基添加50 μ L氨苄霉素)、异丙基-β -D-硫代吡喃半半乳糖苷(IPTG)、LB培养基粉、甲酸、QuickCut Hind Ⅲ 限制性内切酶、QuickCut EcoR I限制性内切酶和DNA凝胶回收试剂盒, 购于日本TaKaRa公司; Taq PCR Mastermix, 购于康为世纪生物公司; Ni-NTA亲和层析凝胶树脂试剂盒、In-Fusion克隆试剂盒, 购于美国Clontech公司; DNA Marker、11~245 ku蛋白质Marker和质粒抽提试剂盒, 购于天根生化科技(北京)有限公司; LB培养基、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、蛋白质染色液和蛋白质脱色液, 购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2.1 目的基因合成

参考文献[4], 设计含有EcoR I和Hind Ⅲ 酶切位点、甲酸切割位点和蛋白质终止密码子的编码Spinosan-D成熟肽的核酸序列(5'-$\underline{GAATTC}$$\underline{GATCCG}$ATGGAGGAGCTCTACAAAGAAATCGACGA TTGTGTGAATTATGGCAATTGTAAAACCTTGAAACT CATGTAA$\underline{AAGCTT}$ -3')。其中, $\underline{GAATTC}$为EcoR Ⅰ 酶切位点, $\underline{AAGCTT}$为Hind Ⅲ 酶切位点, $\underline{GATCCG}$为甲酸切割位点。利用TaKaRa Clotech在线生成基因序列软件设计特异性引物F(5'-ATCGGATCC$\underline{GAATTC}$GATCCGATGGAGGAGCTCTA CAAA-3')和R(5'-TGCGGCCGC$\underline{AAGCTT}$TTACAT GAGTTTCAAGGTTTTACAATTGCCATA-3'), 全基因合成于T-Vector pMD19普通载体上。PCR反应体系为:DNA模板1 μ L, 上、下游引物各1 μ L, 反应混合液12.5 μ L, 加ddH₂O至25 μ L。PCR反应程序为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共29个循环; 72 ℃ 10 min; 4 ℃保存。反应结束后以1%琼脂糖凝胶电泳分析是否获得所需基因片段。

1.2.2 重组表达质粒的构建及鉴定

用限制性内切酶EcoR I和Hind Ⅲ 双酶切质粒pET-32a(+), 回收线性化载体片段, 取目的基因片段, 用In-Fusion连接酶连接, 构建pET-32a(+)重组表达载体pET-32a(+)-Spinosan-D, 并转化至E.Coli DH5α 感受态细胞, 挑取阳性单克隆进行菌落PCR鉴定。PCR反应体系为:菌液1 μ L, pET-32a(+)通用引物S.TAG、T7 TER各1 μ L, 反应混合液12.5 μ L, 加ddH₂O至25 μ L。PCR反应程序为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共29个循环; 72 ℃ 10 min; 4 ℃保存。PCR产物送至上海生工生化公司测序, 运用Seqman和MEGA序列分析软件分析测序结果。

1.2.3 重组质粒的诱导表达

转化重组质粒至E.Coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞中, 再转入另一培养基, 37 ℃、200 r· min^-1摇床培养至菌液的D₆₀₀值为0.7。取1 mL菌液作为诱导前样品, 1 mL菌液中加入终浓度为1 mmol· L^-1IPTG进行诱导表达(37 ℃、160 r· min^-1条件下振摇4 h), 取1 mL菌液作为诱导后样品。取诱导前、后样品, 12 000 r· min^-1离心2 min, 各加入40 μ L PBS溶液悬浮菌体沉淀, 加入10 μ L的5× 蛋白上样缓冲液, 以100 ℃煮沸10 min, 取上清, 分别取处理过的样品各20 μ L, 进行12% SDS-PAGE电泳检测。

1.2.4 诱导条件优化

不同诱导表达条件下, 蛋白的表达量不同。为使蛋白得到高效表达, 进行诱导温度(16 ℃、28 ℃、37 ℃)、诱导时间(4、8、12 h)及IPTG终浓度(0.1、0.5、1.0 mmol· L^-1)3因素3水平正交试验, 探索最佳诱导表达条件, 12% SDS-PAGE电泳检测表达结果。

1.2.5 重组蛋白的纯化

以最佳诱导条件对重组菌进行大量诱导表达, 离心收集菌体, 冰上超声裂解, 离心, 收集上清并过滤, 对重组蛋白进行纯化, 收集蛋白洗脱液, 12% SDS-PAGE电泳分析目的蛋白。洗脱的目的蛋白加入终浓度为40%的甲酸, 37 ℃培养36 h, 37 ℃氮吹出去甲酸, 加入1× PBS溶液清洗3次, 最后用1× PBS溶液溶解。

1.2.6 重组蛋白生物活性检测

将一定浓度的E.Coli DH5α 菌液均匀涂布于固体培养基表面, 将灭菌滤纸片按合适间距置于培养基表面, 分别加入10 μ L 1× PBS溶液、抗菌肽、1 mg· mL^-1氨苄霉素, 封口膜密封培养皿, 水平倒置, 置于37 ℃恒温培养箱中过夜培养, 观察抑菌圈是否形成及其大小。其中, 氨苄霉素处理作为阳性对照, 1× PBS溶液处理作为阴性对照。

Spinosan-D基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析大小为108 bp(图1), 目的基因片段扩增成功。

图1

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	图1 Spinosan-D基因的扩增电泳 M, DNA分子质量标准; a, Spinosan-D基因扩增产物

使用限制性内切酶EcoRⅠ 和Hind Ⅲ 对质粒pET-32a(+)进行双酶切, 1%琼脂糖凝胶电泳对双酶切后的线性化载体进行分析(图2), 条带符合预期结果, 成功获得线性化载体。纯化回收的线性化载体, 经酶标仪测量, 浓度为14.5 ng· μ L^-1, 目的基因片段浓度为62.5 ng· μ L^-1。

图2

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	图2 质粒的双酶切鉴定 M, DNA分子质量标准; a, 经双酶切的线性化pET-32a(+)载体; b, 未经双酶切的环状pET-32a(+)载体

菌液PCR后经1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小为267 bp(图3), 符合预期结果, 初步鉴定重组质粒构建成功。基因测序结果表明, 已成功构建重组质粒。

图3

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	图3 菌液PCR扩增产物的鉴定 M, DNA分子质量标准; a, 菌液PCR扩增产物

对含重组质粒的E.Coli BL21(DE3)pLysS大肠杆菌诱导表达后, 结果表明, 含IPTG诱导剂的目的条带大小处有蛋白表达, 而无IPTG诱导剂的在目的条带大小处无蛋白表达(图4), 表明融合蛋白在诱导剂IPTG作用下已经成功表达。

图4

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	图4 重组质粒的诱导表达 M, 蛋白质分子质量标准; a, 诱导前; b, 诱导后

研究发现, 37 ℃条件下, 融合蛋白的表达量更多(图5), 故将最佳诱导温度定为37 ℃。37 ℃条件下, 不同诱导时间表达的融合蛋白量差异不明显, 选择最短处理时间4 h为诱导时间。在37 ℃、诱导4 h时, 1.0 mmol· L^-1 IPTG诱导表达的融合蛋白最多, 故最佳诱导条件为:37 ℃, 1.0 mmol· L^-1 IPTG处理4 h。

图5

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	图5 不同诱导条件下重组质粒的诱导表达 A、B、C分别为16 ℃、28 ℃、37 ℃时不同IPTG终浓度及诱导时间下重组质粒的诱导表达。M, 蛋白质分子质量标准; a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3分别表示诱导时间和IPTG终浓度为4 h、0.1 mmol· L-1, 4 h、0.5 mmol· L-1, 4 h、1.0 mmol· L-1, 8 h、0.1 mmol· L-1, 8 h、0.5 mmol· L-1, 8 h、1.0 mmol· L-1, 12 h、0.1 mmol· L-1, 12 h、0.5 mmol· L-1, 12 h、1.0 mmol· L-1诱导条件下的重组质粒诱导表达

纯化蛋白样和未纯化蛋白样在20~25 ku有一条明显条带, 约为21.2 ku(图6), 符合预期结果, 因此纯化蛋白样成功。

图6

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	图6 Ni离子亲和层析法纯化抗菌肽Spinosan-D M, 蛋白质分子质量标准; a, 纯化后; b, 纯化前

在E.Coli DH5α 菌株生长的平板上, 阴性对照的PBS溶液周围菌株生长正常; 阳性对照的氨苄霉素周围有抑菌圈; 重组蛋白Spinosan-D周围也存在抑菌圈(图7), 表明抗菌肽Spinosan-D具有一定的抗菌活性。

图7

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	图7 抑菌试验的结果 1, 1 mg· mL-1氨苄霉素处理; 2, 1× PBS溶液处理; 3, 抗菌肽处理