猪大肠埃希菌和沙门氏菌双重PCR检测方法的建立

doi:10.16178/j.issn.0528-9017.20220686

摘要/Abstract

摘要：

旨在建立一种针对猪大肠埃希菌和沙门氏菌的特异、高效的双重PCR检测方法并应用于临床样品检测。本研究针对大肠埃希菌保守序列16SrRNA基因和沙门氏菌的特异性基因侵袭蛋白A基因(invA),采用Primer 3.0 Plus 分别设计合成两对特异性引物,在此基础上建立并优化双重PCR反应体系。结果显示,该双重PCR检测方法能有效扩增出猪大肠埃希菌和沙门氏菌的144 bp和610 bp的特异性片段,PCR产物测序结果为目标片段;对副猪嗜血杆菌、产气荚膜梭菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、链球菌的扩增结果均为阴性。将该方法应用于临床样品检测,对55例病猪的血液和组织样品进行分离检测,检测出大肠埃希菌12例,沙门氏菌4例,混合感染1例,与已报道的PCR检测方法符合率为98.20%。表明该研究建立的双重PCR体系可为临床猪大肠埃希菌、沙门氏菌及混合感染提供一种灵敏且高效的检测方法。

中图分类号:

S828.9

徐翔飞, 黄盼, 崔雪梅, 黄叶娥, 季权安, 韦强, 肖琛闻, 鲍国连, 刘燕. 猪大肠埃希菌和沙门氏菌双重PCR检测方法的建立[J]. 浙江农业科学, 2023, 64(4): 957-963.

图/表 11

表1 引物序列

引物名称	序列5'→3'	扩增片段大小/bp
P1	GTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTAC	144
P2	GGGATTTCACATCTGACTTAACAAAC
P3	ATGCCCGGTAAACAGATGAG	610
P4	CGCCAATCAGTCCTAACGAT

图1 E. coli和Sal单一PCR扩增结果 M表示DL 2000 DNA marker,1表示大肠埃希氏菌,2表示沙门氏菌。

表2 PCR扩增结果在NCBI上比对结果

类型	基因	登录号	同源性/%
E.coli	16S rRNA	KF722462.1	100.00
	16S rRNA	GU644489.1	100.00
	16S rRNA	GU644473.1	100.00
	16S rRNA	AM157447.1	100.00
	16S rRNA	CP076241.1	100.00
Sal	全基因组	CP053865.1	98.86
	全基因组	CP051276.1	98.86
	全基因组	CP050728.1	98.86
	全基因组	AP023319.1	98.86
	全基因组	CP060507.1	98.86

图2 E.coli PCR扩增条件优化 A图中M表示DL 2000 DNA marker,1~21表示退火温度 50~70 ℃,每往右一列递增1 ℃;B图中M表示DL 2000 DNA marker,1~6表示退火时间10~60 s,每往右一列递增10s;C图中M表示DL 2000 DNA marker,1~10表示引物浓度0.2~2.0 μL,每往右一列递增0.2 μL。

图3 Sal PCR扩增条件优化 A图中M表示DL 2000 DNA marker,1~21表示退火温度 50~70 ℃,每往右一列递增1 ℃;B图中M表示DL 2000 DNA marker,1~6表示退火时间10~60 s,每往右一列递增10 s;C图中M表示DL 2000 DNA marker,1~10表示引物浓度0.2~2.0 μL,每往右一列递增0.2 μL。

图4 E. coli和Sal特异性检验 A、B图中M表示均DL 2000 DNA marker,1~7均表示大肠埃希菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、产气荚膜梭菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、链球菌大肠埃希菌。

图5 E. coli+Sal双重PCR条件优化 A图中M表示DL 2000 DNA marker,1~21表示退火温度 50~70 ℃,每往右一列递增1 ℃;B图中M表示DL 2000 DNA marker,1~6表示退火时间10~60 s,每往右一列递增10 s;C图中M表示DL 2000 DNA marker,1~4表示引物浓度1 μL +1 μL、1.5 μL+1.5 μL、1 μL+1.5 μL、1.5 μL+1 μL。

图6 E.coli+Sal双重PCR特异性检验 M表示DL 2000 DNA marker,1~8表示大肠埃希菌和沙门氏菌混合物、大肠埃希菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、产气荚膜梭菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、链球菌。

图7 E. coli+Sal双重PCR重复性实验 M表示DL 2000 DNA marker,1~3表示E. coli+Sal混合物重复3次,4表示无菌水。

表3 双重PCR扩增结果在NCBI上比对结果

类型	基因	登录号	同源性/%
E.coli	16S rRNA	KF722462.1	100.00
	16S rRNA	GU644489.1	100.00
	16S rRNA	GU644473.1	100.00
	16S rRNA	AM157447.1	100.00
	16S rRNA	CP076241.1	100.00
Sal	全基因组	CP053865.1	99.83
	全基因组	CP051276.1	99.83
	全基因组	CP050728.1	99.83
	全基因组	AP023319.1	99.83
	全基因组	CP060507.1	99.83

图8 双重PCR的临床应用 M表示DL 2000 DNA marker,1~12表示大肠埃希菌,13~16表示沙门氏菌,17表示大肠埃希菌和沙门氏菌混合感染,18表示无菌水。

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