非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

doi:10.16178/j.issn.0528-9017.20220708

浙江农业科学 ›› 2023, Vol. 64 ›› Issue (4): 964-967.DOI: 10.16178/j.issn.0528-9017.20220708

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

余斌(), 徐丽华, 李军星, 苏菲, 叶十一, 袁秀芳()

浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州 310021

收稿日期:2022-06-23 出版日期:2023-04-11 发布日期:2023-03-29
通讯作者: 袁秀芳
作者简介:袁秀芳(1968—),女,黑龙江牡丹江人,副研究员,博士,主要从事猪病预防研究工作,E-mail:xiufangyuan@126.com。
余斌(1980—),男,湖北黄冈人,助理研究员,硕士,主要从事猪病预防研究工作,E-mail:biogiant@126.com。
基金资助:
浙江省重点研发计划(2020C02012)

Received:2022-06-23 Online:2023-04-11 Published:2023-03-29

摘要/Abstract

摘要：

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示:本研究所建立的检测方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;灵敏度高,能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好,组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑,为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。

关键词: 非洲猪瘟病毒, 荧光定量PCR, B646L, 检测

中图分类号:

S828.9

余斌, 徐丽华, 李军星, 苏菲, 叶十一, 袁秀芳. 非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 浙江农业科学, 2023, 64(4): 964-967.

图/表 6

表1 引物和探针序列

名称	引物(探针)序列(5'-3')	靶基因	扩增长/ bp
ASFV-F	GCTGATACGTGTCCATAA	B646L	130
ASFV-R	GGAGATGTTCCAGGTAGG
ASF-Probe	FAM-CACCAACAATAACCACCACGATGAA-BHQ1

图1 重组质粒双酶切鉴定 M—DNA 分子质量标准,1—重组质粒pUC57-B646L,2—pUC57-B646L双酶切产物。

图2 pUC57-B646L标准质粒扩增曲线 1~9表示1×109~1×101 copies·μL-1。

图3 pUC57-B646L质粒标准曲线

图4 ASFV-qPCR特异性扩增曲线 1表示pUC57-B646L阳性对照,2~8分别为CSFV、PPV、PRV、PCV-2、PRRSV、TGEV、PEDV。

表2 ASFV-qPCR稳定性试验

组	指标	1	2	3	4
组间	均值±方差	18.82±0.26	22.53±0.32	26.59±0.19	30.07±0.07
	变异系数CV/%	1.40	1.40	0.74	0.26
组内	均值±方差	19.01±0.03	22.70±0.02	26.39±0.02	29.70±0.06
	变异系数CV/%	0.15	0.11	0.10	0.20

参考文献 8

[1]	殷震, 刘景华. 动物病毒学[M]. 2版. 北京: 科学出版社,1997.
[2]	(美) B.E. 斯特劳,加S.D. 阿莱尔,美W. L.蒙加林, 等. 猪病学[M]. 杨汉春,译. 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 2022.
[3]	杜楠楠, 高飞, 姜一峰, 等. 非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 中国兽医科学, 2020, 50(4):423-429.
[4]	王志亮, 吴晓东, 王君玮. 非洲猪瘟[M]. 北京: 中国农业出版社, 2015.
[5]	王清华, 任炜杰, 包静月, 等. 我国首例非洲猪瘟的确诊[J]. 中国动物检疫, 2018(9):1-4.
[6]	KING D P, REID S M, HUTCHINGS G H, et al. Development of a TaqMan^® PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus[J]. Journal of Virological Methods, 2003, 107(1): 53-61.
[7]	戈胜强, 屈海龙, 路皓东, 等. 全球基因Ⅰ型非洲猪瘟病毒流行与疫苗研究进展[J]. 中国动物检疫, 2021, 38(12):70-76.
[8]	张志, 葛栋, 李翠翠, 等. 基于全面质量管理提升实验室非洲猪瘟病毒检测能力[J]. 中国动物检疫, 2021, 38(1):65-68.

[1]	万林生, 孙红芹, 倪正斌, 韩配配, 陈志爱. 萝卜与甘蓝型油菜远缘杂交形成新种质的研究与探讨[J]. 浙江农业科学, 2023, 64(3): 632-634.
[2]	郝芳敏, 丁伟红, 马二磊, 严蕾艳, 黄芸萍, 王毓洪, 臧全宇. PMA-qPCR方法快速检测细菌性果斑病菌活菌的研究[J]. 浙江农业科学, 2023, 64(3): 664-669.
[3]	马燕欣, 郎淑平, 袁晔, 陈婕. 特色芋艿病毒病检测及组培体系优化研究[J]. 浙江农业科学, 2023, 64(1): 217-220.
[4]	袁方池, 林云卓雅, 邓欣, 汤沁婴, 蓝陈平, 金子, 韩宝瑜, 王梦馨. 农产品中邻苯二甲酸酯类（PAEs）的提取、检测和污染状况的研究进展[J]. 浙江农业科学, 2022, 63(11): 2619-2626.
[5]	胡施祺, 戴德江, 罗金燕, 朱洁, 安千里, 李斌. 猕猴桃溃疡病病菌的多样性及其检测技术[J]. 浙江农业科学, 2022, 63(11): 2652-2657.
[6]	曲苗, 闫向民, 孙亚伟, 李娜, 王传军, 王成成, 李红波, 张杨, 姚刚. 不同时期西门塔尔肉牛生殖激素变化及相关性分析[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(8): 1615-1620.
[7]	虞冰, 林琴, 张春荣, 吴园园, 郭钤, 汤涛. 烷基酚聚氧乙烯醚及相关代谢物检测方法研究进展[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(6): 1181-1187.
[8]	王盼, 康华靖, 胡轶娟, 徐尉城, 周钰鸿, 陈子林. 2个生态型三叶青块根主要药用成分动态检测与比较[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(3): 532-535.
[9]	白丽萍, 王伟, 王强, 王君虹, 张玉, 朱杰. 近红外光谱快速检测葡萄酒品质[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(2): 389-391.
[10]	王宏宇, 朱寅初, 云涛, 华炯钢, 叶伟成, 倪征, 陈柳, 张存. 不同基因型鹅星状病毒鉴别诊断RT-PCR方法的建立[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(11): 2299-2302.
[11]	朱勇, 付岩. 浅析农产品中测定400种以上农药残留常用的6个液质标准[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(1): 125-128.
[12]	庄新建, 徐红梅, 甘海峰, 贺振, 刘芳, 张坤. 中国常见水稻病毒病鉴定方法研究进展[J]. 浙江农业科学, 2020, 61(9): 1821-1832.
[13]	耿敬章, 陈俊杰, 杨萌, 孟莉, 贺博, 唐德剑, 杨水云. 富硒叶面肥安全性评估方法建立[J]. 浙江农业科学, 2020, 61(7): 1440-1441.
[14]	何欣, 柳爱春, 刘超, 白俊慧, 虞轶俊, 赵芸, 丁明. 液相色谱串联质谱快速检测水中喹诺酮类药物及其应用[J]. 浙江农业科学, 2020, 61(6): 1241-1245.
[15]	季天委, 汪玉磊, 钟杭, 俞丹宏. 国标法与电感耦合等离子体质谱法测定土壤铜铬铅镉含量结果对比[J]. 浙江农业科学, 2020, 61(5): 1031-1033.

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

RichHTML

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 6

参考文献 8

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价