柑橘黄龙病早期诊断的PCR检测技术优化

doi:10.16178/j.issn.0528-9017.20210433

摘要/Abstract

摘要：

柑橘黄龙病是柑橘属植物主要病害之一,是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起的病害,病菌可随筛管转运至整个植株,其潜伏周期长、危害面积广,严重威胁我国乃至世界范围内柑橘产业的健康发展。因此,早期柑橘黄龙病的快速检测是病害防治重要环节,目前最常用的是基于PCR技术的检测方法,但由于植株体内的病菌含量较低、PCR扩增体系中引物稳定性的差异、DNA模板浓度的不同均会对扩增效果有较大影响。本研究以感染黄龙病的柑橘叶片作为样本,提取叶片DNA作为模板。利用LSS606/LAS、16sf/16sr、A2/J5、P1/P2和OI1/OI2 5对柑橘黄龙病检测引物对PCR反应体系进行了优化。结果显示,除了OI1/OI2引物的特异性较差外,其余4种引物均表现了很好的特异性,引物浓度在0.2~0.3 μmol时,PCR扩增效果较好。灵敏度检测显示引物LSS606/LAS、A2/J5对模板DNA的灵敏度较高,在模板浓度为0.048 ng·μL^-1时仍能扩增出目标产物,分别是引物16sf/16sr和P1/P2检测灵敏度的10倍和20倍,可检测出1 ng总DNA中的柑橘黄龙病菌数在426~755。该研究通过特异性引物的筛选以及PCR检测体系的优化,确定了一种快速准确检测柑橘黄龙病的方法,为柑橘黄龙病的早期诊断奠定基础。

关键词: 黄龙病, 引物, PCR, 灵敏度, 特异性

中图分类号:

S436

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图/表 6

表1 引物序列及预期扩增片段长度

引物名称	序列(5'→3')	GC含量/%	Tm值	产物大小/bp
LSS606/LAS	ACCCAACATCTAGGTAAAAACC	40.9	54.3	500
	GGAGAGGTGAGTGGAATTCCGA	54.0	58.9
P1/P2	TCTGTTTTCTTCGAGGTTGGTGAG	45.5	55.8	563
	ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG	54.2	61.2
16sf/16sr	TCGAGCGCGTATGCAATACG	55.0	58.3	502
	ATTTCACCTCTAACTTAATC	30.0	42.8
OI1/OI2	TCTGTTTTCTTCGAGGTTGGTGAG	45.0	51.8	1 167
	ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG	63.2	60.9
A2/J5	TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT	33.3	51.0	703
	ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA	36.0	54.9

表2 PCR反应程序

反应	时间/min	温度/℃
预变性	5	95
变性	0.5	95
退火	0.5	50~60
延伸	0.5	72
延伸	10	72
保存	∞	4

图1 引物特异性的检测情况 M为DNA marker;1~3为引物LSS606/LAS特异性检测结果;4~6为引物A2/J5特异性检测结果;7~9为引物P1/P2特异性检测结果;10~12为引物16sf/16sr特异性检测结果;13~15为引物OI1/OI2特异性检测结果。其中,每组模板顺序分别是黄龙病病菌、阴性对照、柑橘叶片腐生菌。

表3 各引物的优化反应体系

引物	Mix/ μL	引物/ μL	模板/ μL	ddH₂O/ μL	总体系/ μL
LAS606/LSS	10	0.4	4.0	5.2	20
A2/J5	10	0.5	4.0	4.8	20
16sf/16sr	10	0.6	4.0	4.8	20
P1/P2	10	0.6	4.0	4.8	20

图2 引物浓度优化的电泳结果左上图为引物16sf/16sr浓度优化结果,右上为LSS606/LAS浓度优化结果,左下为A2/J5浓度优化结果,右下为P1/P2浓度优化结果;1~6引物浓度依次为0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5 μmol,M为DNA marker。

图3 引物LSS606/LAS,P1/P2,16sf/16sr与A2/J5灵敏度分析左上为引物LSS606/LAS,右上为引物P1f/P1r,左下为引物16sf/16sr,右下为引物A2/J5(1~12稀释倍数依次为10、100、200、500、800、1 000、1 500、2 000、2 500、5 000、8 000、10 000)。

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