PMA-qPCR方法快速检测细菌性果斑病菌活菌的研究

doi:10.16178/j.issn.0528-9017.20220410

浙江农业科学 ›› 2023, Vol. 64 ›› Issue (3): 664-669.DOI: 10.16178/j.issn.0528-9017.20220410

PMA-qPCR方法快速检测细菌性果斑病菌活菌的研究

郝芳敏(), 丁伟红, 马二磊, 严蕾艳, 黄芸萍, 王毓洪, 臧全宇()

宁波市农业科学研究院宁波瓜菜育种重点实验室, 浙江宁波 315040

收稿日期:2022-09-15 出版日期:2023-03-11 发布日期:2023-03-11
通讯作者: 臧全宇
作者简介:臧全宇(1982—),女,河北承德人,高级农艺师,硕士,主要从事甜瓜育种及栽培技术研究工作,E-mail:zqy0711@163.com。
郝芳敏(1990—),女,河南新乡人,助理研究员,博士,主要从事甜瓜抗病育种研究工作,E-mail:haofangmin@163.com。
基金资助:
宁波市农业科学研究院瓜菜良种良法创新工程项目-瓜类健康种子生产及采后加工检测技术研究(2019CXGC002);浙江省西甜瓜良种育繁推科技创新平台(ZJ2019-80);国家西甜瓜产业技术体系(nycytx-36);宁波市瓜菜育种重点实验室(2014A22007)

Received:2022-09-15 Online:2023-03-11 Published:2023-03-11

摘要/Abstract

摘要：

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与qPCR技术相结合,建立了一种适于细菌性果斑病菌株活细胞快速检测的PMA-qPCR方法。通过试验控制单因素变化,对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为9 μg·mL^-1,曝光时间为8 min的PMA预处理体系,能有效抑制1.0×10⁷ mL^-1灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在2.0×10¹~2.0×10⁶ mL^-1,qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R²=0.982 7)。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除细菌性果斑病死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性果斑病的流行规律研究提供新的技术支撑,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

关键词: 细菌性果斑病菌, 叠氮溴化丙锭, 活菌检测, 快速检测

中图分类号:

S652

郝芳敏, 丁伟红, 马二磊, 严蕾艳, 黄芸萍, 王毓洪, 臧全宇. PMA-qPCR方法快速检测细菌性果斑病菌活菌的研究[J]. 浙江农业科学, 2023, 64(3): 664-669.

图/表 9

图1 荧光定量PCR扩增Acidovorax citrulli基因组DNA的标准曲线

图2 不同浓度PMA对细菌性果斑病菌活细胞DNA荧光定量PCR扩增的影响柱上无相同字母者表示差异明显(P<0.05),图3~5同。

图3 不同浓度PMA对细菌性果斑病菌死细胞DNA荧光定量PCR扩增的影响

图4 不同PMA曝光时间对细菌性果斑病菌活细胞DNA荧光定量PCR扩增的影响

图5 不同PMA曝光时间对细菌性果斑病菌死细胞DNA荧光定量PCR扩增的影响

图6 活、死细胞混合体系中PMA-qPCR的选择性扩增柱上无相同大写字母表示未加PMA处理间差异极显著(P<0.01);柱上无相同小写字母表示加PMA处理间差异显著(P<0.05)。

图7 PMA-qPCR扩增A. citrulli活菌细胞数的标准曲线

表1 不同方法对细菌性果斑病菌死细胞检测效果比较

死细胞浓度/ mL^-1		Ct值				平板计数法/ mL^-1
死细胞浓度/ mL^-1		qPCR		PMA-qPCR		平板计数法/ mL^-1
10⁴	31.86		37.84		0
10³	34.84		UD		0
10²	36.87		UD		0
10¹	37.15		UD		0
10	UD		UD		0
10^-1	UD		UD		0
10^-2	UD		UD		0
0	UD		UD		0

表2 田间甜瓜种子样品的PMA-qPCR检测

样品编号	活菌Ct值		死菌Ct值 (PMA-qPCR法)	BFB平板分离
样品编号	qPCR	PMA-qPCR	死菌Ct值 (PMA-qPCR法)	BFB平板分离
1	18.67	19.46	>35	+
2	27.49	>35.00	>35	-
3	31.65	33.64	>35	+
4	>35.00	>35.00	>35	-
5	>35.00	>35.00	>35	-
6	28.32	29.01	>35	+
7	33.64	32.77	>35	+
8	23.34	24.41	>35	+
9	33.46	>35.00	>35	-
10	>35.00	>35.00	>35	-

参考文献 17

[1]	SCHAAD N W, POSTNIKOVA E, SECHLER A, et al. Reclassification of sub species of Acidovorax avenae as A. Avenae (Manns 1905) emend., A. cattleyae (Pavarino, 1911) comb. nov., A. citrulli Schaad et al., 1978) comb. nov., and proposal of A. oryzae sp. nov[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2008, 31(6/7/8): 434-446. DOI URL
[2]	彭斌, 古勤生. 西瓜嗜酸菌的土壤越冬存活和致病性测定[J]. 植物保护学报, 2014, 41(3): 381-382.
[3]	赵廷昌, 孙福在, 王兵万, 等. 哈密瓜细菌性果斑病病原菌鉴定[J]. 植物病理学报, 2001, 31(4): 357-364.
[4]	GITAITIS R, WALCOTT R. The epidemiology and management of seedborne bacterial diseases[J]. Annual Review of Phytopathology, 2007, 45: 371-397. PMID
[5]	赵丽涵, 王笑, 谢关林, 等. 免疫捕捉PCR法检测西瓜细菌性果斑病[J]. 农业生物技术学报, 2006, 14(6): 946-951.
[6]	宋蕤, 刘箐, 刘雅莉, 等. 西瓜细菌性果斑病菌快速免疫PCR检测[J]. 植物检疫, 2009, 23(2): 4-6.
[7]	吴秀芹, 杨樱子, 罗金燕, 等. 利用环介导等温扩增方法快速检测瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性溃疡病菌[J]. 植物保护学报, 2018, 45(6): 1235-1241.
[8]	张红, 周志诚, 周伟, 等. 瓜类细菌性果腐病病原IAS-PCR检测研究[J]. 新疆农业大学学报, 2005, 28(2): 43-46.
[9]	WALCOTT R R, GITAITIS R D. Detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli in watermelon seed using immunomagnetic separation and the polymerase chain reaction[J]. Plant Disease, 2000, 84(4): 470-474. DOI URL
[10]	冯建军, 许勇, 李健强, 等. 免疫凝聚试纸条和TaqMan探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究[J]. 植物病理学报, 2006, 36(2): 102-108.
[11]	回文广, 赵廷昌, SCHAAD N W, 等. 哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立[J]. 中国农业科学, 2007, 40(11): 2495-2501.
[12]	NOCKER A, SOSSA-FERNANDEZ P, BURR M D, et al. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5111-5117. PMID
[13]	CAWTHORN D M, WITTHUHN R C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakiicells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide[J]. Journal of Applied Microbiology, 2008, 105(4): 1178-1185. DOI URL
[14]	TIAN Q, FENG J J, HU J, et al. Selective detection of viable seed-borne Acidovorax citrulli by real-time PCR with propidium monoazide[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 35457. DOI
[15]	刘丹丹, 刘畅. 甜瓜细菌性果斑病菌鉴定及杀菌剂毒力测定[J]. 北方园艺, 2017(18): 6-10.
[16]	肖妍, 刘芸宏, 高贵田, 等. PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究[J]. 食品与机械, 2019, 35(4): 48-53, 59.
[17]	王帅, 徐进, 许景升, 等. PMA-qPCR定量检测青枯菌活菌方法的建立[J]. 植物保护, 2018, 44(6): 122-128, 135.

PMA-qPCR方法快速检测细菌性果斑病菌活菌的研究

RichHTML

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 9

参考文献 17

相关文章 6

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	白丽萍, 王伟, 王强, 王君虹, 张玉, 朱杰. 近红外光谱快速检测葡萄酒品质[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(2): 389-391.
[2]	施文骁1，顾雪迎2，郭庆元2，王洪凯1. 环介导扩增快速检测葡萄根癌病菌技术体系的建立[J]. 浙江农业科学, 2015, 1(12): 2015-.
[3]	柳爱春1，刘超1，赵芸1，陈青舟2，张宣伟2. 胶体金法和质谱法检测禽蛋中喹诺酮类残留的比较[J]. 浙江农业科学, 2015, 1(11): 1763-.
[4]	徐海圣;王美珍;戎华南. 对虾桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速检测方法的建立[J]. , 2013, 1(9): 0-1201.
[5]	叶雪珠;王强;赵首萍;张永志;王钢军. 快速检测尿液中盐酸克伦特罗残留技术评价[J]. , 2013, 1(5): 0-579.
[6]	王森;周亚莲;盛慧萍;桑丽雅;马秋玲;杨光瑞;周建昌. 瘦肉精三合一胶体金快速检测板的研制及在畜肉中的应用[J]. , 2012, 1(12): 0-1719.