基于番鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法建立

doi:10.16178/j.issn.0528-9017.20220111

摘要/Abstract

摘要：

本试验采用经原核表达并纯化的番鸭细小病毒VP3蛋白作为包被抗原，辛酸-硫酸铵沉淀法提取纯化制备的兔抗番鸭IgG酶标抗体作为二抗，经一系列试验，确定了间接ELISA检测番鸭细小病毒抗体的最佳抗原浓度为5 μg·mL^-1，血清的最佳稀释度为1∶100，血清样品稀释液为含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST，兔抗番鸭酶标抗体最适稀释度为1∶2 500。将建立的方法进行了特异性、敏感性、重复性与中和试验的符合性等试验。试验结果表明，阳性血清样品作1 600倍稀释还能检测到抗体；与其他常见鸭传染病的阳性血清无交叉反应；批内、批间重复性试验的变异系数小于8.7%；100份番鸭血清样品用ELISA方法与中和试验的总符合率达90%以上。说明本试验建立的检测方法敏感性高、特异性强、重复性与稳定性好，可用于番鸭细小病毒流行病学调查及鸭群免疫番鸭细小病毒疫苗后抗体监测。

关键词: 番鸭细小病毒, VP3蛋白, 抗体, 间接ELISA

中图分类号:

S858.32

叶伟成, 云涛, 朱寅初, 倪征, 陈柳, 华炯钢, 张存. 基于番鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法建立[J]. 浙江农业科学, 2022, 63(11): 2740-2745.

图/表 10

参考文献 15

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血清稀释度	项目	VP3蛋白抗原稀释度
血清稀释度	项目	20.000 μg·mL^-1	10.000 μg·mL^-1	5.000 μg·mL^-1	2.500 μg·mL^-1	1.250 μg·mL^-1	0.625 μg·mL^-1
1∶25	P	1.828	1.675	1.618	1.512	1.352	1.050
	N	0.236	0.201	0.171	0.146	0.217	0.265
	P/N	7.746	8.333	9.462	10.356	6.230	3.962
1∶50	P	1.578	1.541	1.329	1.142	0.973	0.659
	N	0.151	0.139	0.117	0.122	0.154	0.184
	P/N	10.450	11.086	11.359	9.361	6.318	3.582
1∶100	P	1.256	1.198	1.025	0.799	0.647	0.412
	N	0.108	0.103	0.088	0.088	0.104	0.119
	P/N	11.629	11.631	11.648	8.998	6.221	3.462
1∶200	P	0.899	0.852	0.705	0.514	0.389	0.256
	N	0.093	0.083	0.079	0.080	0.086	0.098
	P/N	9.667	10.265	8.924	6.425	4.523	2.612

血清稀释度	项目	VP3蛋白抗原稀释度
血清稀释度	项目	20.000 μg·mL^-1	10.000 μg·mL^-1	5.000 μg·mL^-1	2.500 μg·mL^-1	1.250 μg·mL^-1	0.625 μg·mL^-1
1∶25	P	1.828	1.675	1.618	1.512	1.352	1.050
	N	0.236	0.201	0.171	0.146	0.217	0.265
	P/N	7.746	8.333	9.462	10.356	6.230	3.962
1∶50	P	1.578	1.541	1.329	1.142	0.973	0.659
	N	0.151	0.139	0.117	0.122	0.154	0.184
	P/N	10.450	11.086	11.359	9.361	6.318	3.582
1∶100	P	1.256	1.198	1.025	0.799	0.647	0.412
	N	0.108	0.103	0.088	0.088	0.104	0.119
	P/N	11.629	11.631	11.648	8.998	6.221	3.462
1∶200	P	0.899	0.852	0.705	0.514	0.389	0.256
	N	0.093	0.083	0.079	0.080	0.086	0.098
	P/N	9.667	10.265	8.924	6.425	4.523	2.612

样品稀释液	P	N	P/N
5% BSA	1.760	0.525	3.352
10% BSA	1.689	0.509	3.318
15% BSA	1.671	0.466	3.586
5% FBS	1.648	0.378	4.360
10% FBS	1.513	0.378	4.003
15% FBS	1.479	0.352	4.202
5%脱脂奶粉	1.537	0.234	6.568
10%脱脂奶粉	1.598	0.191	8.366
15%脱脂奶粉	1.502	0.187	8.032
5%脱脂奶粉+5% FBS	1.622	0.222	7.306
10%脱脂奶粉+10% FBS	1.454	0.160	9.088
15%脱脂奶粉+15% FBS	1.434	0.223	6.430

样品稀释液	P	N	P/N
5% BSA	1.760	0.525	3.352
10% BSA	1.689	0.509	3.318
15% BSA	1.671	0.466	3.586
5% FBS	1.648	0.378	4.360
10% FBS	1.513	0.378	4.003
15% FBS	1.479	0.352	4.202
5%脱脂奶粉	1.537	0.234	6.568
10%脱脂奶粉	1.598	0.191	8.366
15%脱脂奶粉	1.502	0.187	8.032
5%脱脂奶粉+5% FBS	1.622	0.222	7.306
10%脱脂奶粉+10% FBS	1.454	0.160	9.088
15%脱脂奶粉+15% FBS	1.434	0.223	6.430

封闭液	样品稀释液BSA的浓度（PBST）			样品稀释液FBS的浓度（PBST）			10%脱脂奶粉的PBST	含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST
封闭液	5%	10%	15%	5%	10%	15%	10%脱脂奶粉的PBST	含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST
5% BSA	4.341	4.234	4.294	5.160	5.523	6.148	9.772	9.822
10% BSA	4.753	4.463	4.530	5.413	5.826	6.502	9.174	10.992
15% BSA	5.092	4.846	5.078	5.110	5.858	7.436	8.176	9.260
5%明胶	3.560	3.672	3.718	4.542	5.069	6.091	8.452	9.053
10%明胶	3.294	3.276	3.397	4.088	4.768	5.538	7.268	7.764
15%明胶	3.489	3.124	3.402	3.706	4.319	5.084	6.672	7.480
5% FBS	4.404	4.397	4.335	5.518	5.585	7.224	8.774	11.885
10% FBS	4.170	3.235	4.000	6.667	4.853	6.027	8.761	10.157
15% FBS	4.275	3.829	3.746	4.098	4.480	6.442	5.869	8.476
10%脱脂奶粉	3.352	3.318	3.358	4.360	4.003	4.202	8.366	9.088

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血清	酶标二抗体稀释度
血清	1∶1 500	1∶2 000	1∶2 500	1∶3 000	1∶3 500	1∶4 000	1∶4 500
P	1.395	1.245	1.126	0.976	0.871	0.782	0.724
N	0.204	0.167	0.130	0.126	0.118	0.107	0.108
P/N	6.834	7.456	8.660	7.746	7.381	7.308	6.704

血清	稀释倍数	D₄₅₀
MDPV阳性血清	100	1.243
	200	0.834
	400	0.598
	800	0.428
	1 600	0.318
	3 200	0.187
阴性血清	100	0.126

血清样品		批内重复性试验			批间重复性试验
血清样品		D₄₅₀	标准差	变异系数/%	D₄₅₀	标准差	变异系数/%
1	阳性血清	1.232	0.097	7.9	1.123	0.074	6.6
2	阳性血清	1.233	0.054	4.4	1.197	0.028	2.3
3	阳性血清	0.684	0.057	8.3	0.646	0.049	7.6
4	阳性血清	0.659	0.048	7.3	0.558	0.044	7.9
5	阴性血清	0.118	0.005	4.2	0.127	0.011	8.7

	中和试验	ELISA	结果相同数	总计	符合率/%
阳性血清数	67	71	66	72	91.7
阴性血清数	33	29	29	33	87.9
总计	100	100	95	105	90.5

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