猪巴氏杆菌和波氏杆菌双重PCR检测方法的建立

doi:10.16178/j.issn.0528-9017.20220952

摘要/Abstract

摘要：

本文旨在建立一种针对猪巴氏杆菌和波氏杆菌的特异、高效的双重PCR检测方法并应用于临床样品检测。根据巴氏杆菌和波氏杆菌保守序列16S rRNA基因为靶基因,应用Primer 3.0 Plus软件设计了2对引物,在此基础上建立并优化双重PCR反应体系。结果显示,该双重PCR检测方法能有效扩增出猪巴氏杆菌和波氏杆菌的172和519 bp的特异性片段,PCR扩增产物测序结果为目标片段;对副猪嗜血杆菌、产气荚膜梭菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、链球菌的扩增结果均为阴性。将该方法应用于临床样品检测,对63例呼吸道症状的病猪的鼻拭子和肺脏进行细菌分离,其中10份样品检测出巴氏杆菌,8份样品检测出波氏杆菌,2份为巴氏杆菌和波氏杆菌混合感染,与已报道的PCR检测方法符合率为100%。表明该研究建立的双重PCR体系可为临床猪巴氏杆菌、波氏杆菌及混合感染提供一种灵敏且高效的检测方法。

关键词: 猪, 巴氏杆菌, 波氏杆菌, 双重PCR

中图分类号:

S858.28

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图/表 10

图1 巴氏杆菌和波氏杆菌PCR扩增结果 M表示DNA 标准DL 2 000;1表示巴氏杆菌,2表示波氏杆菌。

表1 PCR扩增结果在NCBI比对结果

类型	基因	登录号	同源性/%
Pm	16S	CP048792.1	100.00
	16S	CP048042.1	100.00
	16S	MN588319.1	100.00
	16S	MN588317.1	100.00
	16S	MN080875.1	100.00
Bb	16S	MT040751.1	99.81
	16S	MW452978.1	99.81
	16S	MW207653.1	99.81
	16S	MW207652.1	99.81
	16S	MW207650.1	99.81

图2 巴氏杆菌PCR扩增条件优化 A图中,M表示DNA 标准DL 2 000,1~21表示巴氏杆菌PCR退火温度 50~70 ℃;B图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~6表示巴氏杆菌PCR退火时间10~60 s;C图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~10表示巴氏杆菌PCR引物浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μL。

图3 波氏杆菌PCR扩增条件优化 A图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~21表示波氏杆菌PCR退火温度 50~70 ℃;B图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~6表示波氏杆菌PCR退火时间10~60 s;C图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~10表示波氏杆菌PCR引物浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μL。

图4 巴氏杆菌和波氏杆菌PCR特异性检验 A图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~7表示巴氏杆菌、波氏杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌;B图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~7表示波氏杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、副猪嗜血杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌。

图5 巴氏杆菌+波氏杆菌双重PCR条件优化 A图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~21表示退火温度50~69 ℃;B图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~6表示退火时间10~60 s;C图中M表示DNA 标准DL 2 000,1~4表示引物浓度1 μL+1 μL、1.5 μL+1.5 μL、1 μL+1.5 μL、1.5 μL+1 μL。

图6 巴氏杆菌+波氏杆菌双重PCR特异性检验 M表示DNA 标准DL 2 000,1~8表示巴氏杆菌和波氏杆菌混合物、巴氏杆菌、波氏杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌。

表2 双重PCR扩增结果在NCBI比对结果

类型	基因	登录号	同源性/%
Pm	16S	CP048792.1	100.00
	16S	CP048042.1	100.00
	16S	MN588319.1	100.00
	16S	MN588317.1	100.00
	16S	MN080875.1	100.00
Bb	16S	FJ867620.1	99.38
	16S	MT040725.1	99.18
	16S	JQ953661.1	99.18
	16S	MW207653.1	99.18
	16S	MW207650.1	99.18

图7 巴氏杆菌+波氏杆菌双重PCR重复性实验 M表示 DNA 标准DL 2 000,1~3表示巴氏杆菌+波氏杆菌混合物重复3次,4表示无菌水。

图8 巴氏杆菌和波氏杆菌双重PCR的临床应用 M表示DNA 标准 DL 2 000,1~10表示巴氏杆菌,11~17表示波氏杆菌,18~19表示巴氏杆菌和波氏杆菌混合感染,21表示无菌水。

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